Imunoensaio Portátil Baseado em Papel Combinado com Aplicativo para Smartphone para Detecção Colorimétrica e Quantitativa do Antígeno NS1 da Dengue

A infecção pelo vírus da dengue (DENV) é a doença transmitida por mosquitos de mais rápida propagação¹, e mais de 390 milhões de pessoas estão infectadas com 96 milhões de infecções sintomáticas, 2 milhões de casos de doença grave e mais de 25.000 mortes por ano ocorrem no mundo ^1,2. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que 3,9 bilhões de pessoas estejam em risco de dengue; ~70% vivem em países da Ásia-Pacífico e principalmente no Sudeste Asiático³. Em 2019, o número de casos de dengue relatados à OMS foi de 4,2 milhões, e a Tailândia contribuiu com pelo menos 136.000 casos de dengue e 144 casos de morte por infecção por dengue⁴. O surto de dengue na Tailândia ocorre durante a estação chuvosa, de abril a dezembro, em áreas urbanas e rurais, especialmente na área nordeste.

As infecções por DENV têm diferentes manifestações clínicas, desde sintomas subclínicos, dengue leve (FD) até dengue hemorrágica grave (FHD). A principal característica da condição grave de FHD é o aumento da permeabilidade vascular, seguido de choque e disfunção orgânica¹. A compreensão da via molecular que pode causar o extravasamento vascular é muito importante no desenvolvimento de tratamentos eficazes para a dengue. A proteína não-estrutural 1 (NS1) do dengue é uma glicoproteína secretada durante a infecção viral precoce ^5,6 e funciona como cofator para a replicação do RNA viral⁷. A NS1 pode desencadear a liberação de citocinas e contribuir para o extravasamento vascular ao se ligar ao receptor toll-like 4 (TLR4) e ao glicocálice endotelial ^8,9. Pesquisas in vitro mostraram que a NS1 interage com células endoteliais e induz apoptose. Essa condição pode contribuir para disfunção endotelial e extravasamento vascular¹⁰. Os níveis séricos do antígeno NS1, correlacionados com os níveis séricos de Interleucina (IL)-10, estavam aumentados significativamente em pacientes com doença clínica grave¹¹. A NS1 do dengue também contribui para a patogênese da doença ao induzir IL-10 e suprimir as respostas específicas de células T DENV^12,13. Além disso, a proteína NS1 da dengue foi relacionada à doença clínica grave, e a concentração de NS1 > 600 ng mL-1 nos primeiros 3 dias de doença foi associada ao desenvolvimento de FHD¹⁴.

A persistência do antígeno NS1 da dengue em pacientes com FHD poderia ser utilizada como marcador de dengue^grave6. Existem vários métodos para detectar a NS1 em amostras clínicas, como o ensaio imunoenzimático (ELISA) e o teste^rápido15. O padrão-ouro para medir a concentração de proteínas NS1 em um ambiente clínico é o método ELISA. No entanto, o método ELISA é caro e requer pessoal qualificado e instalações laboratoriais¹⁶. Portanto, o desenvolvimento de tecnologia para detecção e quantificação de proteínas NS1 no teste point-of-care (POCT) ainda está em andamento. Na última década, imunoensaios baseados em papel, como os ensaios de fluxo lateral (LFAs) e dispositivos analíticos microfluídicos baseados em papel (μPADs), tornaram-se populares como testes diagnósticos devido à sua simplicidade, rapidez, baixo custo e especificidade 17,18,19. Em um imunoensaio baseado em papel, vários marcadores têm sido usados para gerar sinais, como nanopartículas de ouro (AuNPs)²⁰, nanopartículas magnéticas^21,22, pontos quânticos²³ e materiais de fluorescência^24,25. AuNPs são os rótulos mais comuns usados em imunoensaios baseados em papel devido ao seu custo barato de produção, facilidade de fabricação, estabilidade e leitura simples. Atualmente, os ensaios de fluxo lateral (AFLs) para a NS1 da dengue são notoriamente utilizados no cenário clínico^26,27. No entanto, a detecção convencional de rótulos de LFA comumente usa o olho nu e fornece apenas resultados qualitativos.

Na última década, mais de 5 bilhões de smartphones foram amplamente utilizados globalmente, e há potencial para o desenvolvimento de detecção portátil^28,29. Os smartphones possuem capacidades multifuncionais, como sensores físicos integrados, processadores multi-core, câmeras digitais, portas USB, portas de áudio, wireless e software aplicativo, tornando-os adequados para uso em diversas plataformas de biossensores³⁰. Além disso, as tecnologias sem fio permitem que os dados sejam enviados rapidamente e podem ser usados para monitoramento em tempo real e no local³¹. combinaram o imunoensaio baseado em papel e smartphones para desenvolver uma plataforma POCT portátil, livre de equipamentos, rápida, de baixo custo e fácil de usar para malária, tuberculose e HIV³². relataram um ensaio de fluxo lateral combinado com uma câmera de smartphone para detectar quantitativamente a atividade da fosfatase alcalina no leite³³. Hou e col. também desenvolveram um sistema de imagem de dupla modalidade baseado em smartphone para sinais quantitativos de cor ou fluorescência no ensaio de fluxo lateral³⁴. Além disso, usar o smartphone como leitor colorimétrico e quantitativo pode melhorar a sensibilidade, enquanto o olho nu não pode relatar com confiança a presença do alvo³⁵.

Apresentando um avanço no diagnóstico da dengue, o DEN-NS1-PAD 36,37,38 (doravante denominado dispositivo) oferece uma solução portátil e eficiente. Usando a tecnologia à base de papel microfluídico impresso em cera, este dispositivo quantifica a NS1 com alta sensibilidade e especificidade através do processamento de imagens. Para melhorar ainda mais sua utilidade, desenvolvemos um aplicativo de smartphone amigável para leitura colorimétrica e quantitativa. A validação clínica usando amostras de pacientes de hospitais tailandeses ressalta seu impacto imediato na avaliação do paciente em tempo real. Nossa inovação marca um avanço fundamental no gerenciamento simplificado da dengue no ponto de atendimento, prometendo revolucionar os diagnósticos em cenários de saúde com recursos limitados.