Immunodosaggio portatile su carta combinato con l'applicazione per smartphone per la rilevazione colorimetrica e quantitativa dell'antigene NS1 della dengue

L’infezione da virus dengue (DENV) è la malattia trasmessa dalle zanzare a più rapida diffusione¹ e più di 390 milioni di persone sono infettate da 96 milioni di infezioni sintomatiche, 2 milioni di casi di malattia grave e più di 25.000 decessi all’anno si verificano nel mondo ^1,2. Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), si stima che 3,9 miliardi di persone siano a rischio di dengue; ~70% vive nei paesi dell’Asia-Pacifico e principalmente nel sud-est asiatico³. Nel 2019, il numero di casi di dengue segnalati all’OMS è stato di 4,2 milioni e la Thailandia ha contribuito con almeno 136.000 casi di dengue e 144 casi di morte per infezione da dengue⁴. L’epidemia di dengue in Thailandia si verifica durante la stagione delle piogge, da aprile a dicembre, sia nelle aree urbane che in quelle rurali, soprattutto nell’area nord-orientale.

Le infezioni da DENV hanno diverse manifestazioni cliniche che vanno dai sintomi subclinici, alla febbre dengue lieve (DF) alla febbre emorragica dengue grave (DHF). La caratteristica principale di una grave condizione di DHF è l’aumento della permeabilità vascolare seguito da shock e disfunzione d’organo¹. Comprendere il percorso molecolare che può causare la perdita vascolare è molto importante nello sviluppo di trattamenti efficaci per la dengue. La proteina non strutturale 1 (NS1) della dengue è una glicoproteina secreta durante l’infezione virale^{precoce 5,6} e funziona come cofattore per la replicazione dell’RNA virale⁷. NS1 può innescare il rilascio di citochine e contribuire alla perdita vascolare legandosi al recettore toll-like 4 (TLR4) e al glicocalice endoteliale ^8,9. La ricerca in vitro ha dimostrato che NS1 interagisce con le cellule endoteliali e induce l’apoptosi. Questa condizione può contribuire alla disfunzione endoteliale e alla perdita vascolare¹⁰. I livelli sierici dell’antigene NS1, correlati con i livelli sierici di interleuchina (IL)-10, sono aumentati significativamente nei pazienti con malattia clinica grave¹¹. La dengue NS1 contribuisce anche alla patogenesi della malattia inducendo IL-10 e sopprimendo le risposte delle cellule T specifiche per DENV^12,13. Inoltre, la proteina NS1 della dengue è stata correlata a una grave malattia clinica e la concentrazione di NS1 > 600 ng mL-1 nei primi 3 giorni di malattia è stata associata allo sviluppo di DHF¹⁴.

La persistenza dell’antigene NS1 della dengue nei pazienti con DHF potrebbe essere utilizzata come marcatore di dengue⁶ grave. Esistono diversi metodi per rilevare NS1 nei campioni clinici, come il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e il test rapido¹⁵. Il gold standard per misurare la concentrazione di proteine NS1 in ambito clinico è il metodo ELISA. Tuttavia, il metodo ELISA è costoso e richiede personale qualificato e strutture di laboratorio¹⁶. Pertanto, lo sviluppo di una tecnologia per rilevare e quantificare le proteine NS1 nel test point-of-care (POCT) è ancora in corso. Nell’ultimo decennio, i test immunologici cartacei come i saggi a flusso laterale (LFA) e i dispositivi analitici microfluidici basati su carta (μPAD) sono diventati popolari come test diagnostici grazie alla loro semplicità, rapidità, economicità e specificità 17,18,19. In un test immunologico su carta, sono state utilizzate diverse etichette per generare segnali, come nanoparticelle d’oro (AuNPs⁾²⁰, nanoparticelle magnetiche^21,22, punti quantici²³ e materiali fluorescenti^24,25. Le AuNP sono le etichette più comuni utilizzate nei test immunologici cartacei grazie al loro basso costo di produzione, alla facilità di fabbricazione, alla stabilità e alla semplice lettura. Attualmente, i saggi a flusso laterale (LFA) per la dengue NS1 sono notoriamente utilizzati in ambito clinico^26,27. Tuttavia, il rilevamento convenzionale delle etichette LFA utilizza comunemente l’occhio nudo e fornisce solo risultati qualitativi.

Nell’ultimo decennio, più di 5 miliardi di smartphone sono stati ampiamente utilizzati a livello globale e c’è il potenziale per sviluppare il rilevamento portatile^28,29. Gli smartphone hanno capacità multifunzionali come sensori fisici integrati, processori multi-core, fotocamere digitali, porte USB, porte audio, wireless e software applicativo, che li rendono adatti per l’uso in varie piattaforme di biosensori³⁰. Inoltre, le tecnologie wireless consentono di inviare rapidamente i dati e possono essere utilizzate per il monitoraggio in tempo reale e in loco³¹. Mudanyali et al. hanno combinato il test immunologico cartaceo e gli smartphone per sviluppare una piattaforma POCT portatile, senza apparecchiature, rapida, a basso costo e facile da usare per la malaria, la tubercolosi e l’HIV³². Ling et al. hanno riportato un test a flusso laterale combinato con la fotocamera di uno smartphone per rilevare quantitativamente l’attività della fosfatasi alcalina nel latte³³. Hou et al. hanno anche sviluppato un sistema di imaging a doppia modalità basato su smartphone per segnali quantitativi da colore o fluorescenza nel saggio a flusso laterale³⁴. Inoltre, l’utilizzo dello smartphone come lettore colorimetrico e quantitativo può migliorare la sensibilità mentre l’occhio nudo non può segnalare con sicurezza la presenza del target³⁵.

Rappresentando una svolta nella diagnostica della dengue, il DEN-NS1-PAD 36,37,38 (d’ora in poi denominato dispositivo) offre una soluzione portatile ed efficiente. Utilizzando la tecnologia microfluidica a base di carta stampata a cera, questo dispositivo quantifica NS1 con elevata sensibilità e specificità attraverso l’elaborazione delle immagini. Per migliorarne ulteriormente l’utilità, abbiamo sviluppato un’app per smartphone di facile utilizzo per la lettura colorimetrica e quantitativa. La convalida clinica utilizzando campioni di pazienti provenienti da ospedali thailandesi sottolinea il suo impatto immediato sulla valutazione dei pazienti in tempo reale. La nostra innovazione segna un progresso fondamentale nella gestione semplificata della dengue point-of-care, promettendo di rivoluzionare la diagnostica in ambienti sanitari con risorse limitate.