Messung der Poly-A-Schwanzlänge aus Drosophila-Larvengehirn und Zelllinien
Summary
Das Protokoll beschreibt eine effiziente und zuverlässige Methode zur Quantifizierung der Poly(A)-Länge des interessierenden Gens aus dem Drosophila-Nervensystem , die leicht an Gewebe oder Zelltypen anderer Spezies angepasst werden kann.
Abstract
Die Polyadenylierung ist eine entscheidende posttranskriptionelle Modifikation, bei der Poly(A)-Schwänze an das 3′-Ende von mRNA-Molekülen angehängt werden. Die Länge des Poly(A)-Schwanzes wird durch zelluläre Prozesse streng reguliert. Eine Dysregulation der mRNA-Polyadenylierung wurde mit abnormaler Genexpression und verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Krebs, neurologische Störungen und Entwicklungsstörungen. Daher ist das Verständnis der Dynamik der Polyadenylierung von entscheidender Bedeutung, um die Komplexität der mRNA-Prozessierung und der posttranskriptionellen Genregulation zu entschlüsseln.
In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung der Poly(A)-Schwanzlängen in RNA-Proben vorgestellt, die aus Drosophila-Larvengehirnen und Drosophila-Schneider-S2-Zellen isoliert wurden. Wir verwendeten den Guanosin/Inosin (G/I)-Tailing-Ansatz, bei dem G/I-Reste enzymatisch am 3′-Ende der mRNA unter Verwendung von Hefe-Poly(A)-Polymerase hinzugefügt werden. Diese Modifikation schützt das 3′-Ende der RNA vor enzymatischem Abbau. Die geschützten Poly(A)-Schwänze in voller Länge werden dann mit einem universellen Antisense-Primer rückwärts transkribiert. Anschließend wird die PCR-Amplifikation mit einem genspezifischen Oligo durchgeführt, das auf das interessierende Gen abzielt, zusammen mit einem universellen Sequenzoligo, das für die reverse Transkription verwendet wird.
Dadurch werden PCR-Produkte erzeugt, die die Poly(A)-Schwänze des interessierenden Gens umfassen. Da die Polyadenylierung keine einheitliche Modifikation ist und zu unterschiedlich langen Schwänzen führt, weisen die PCR-Produkte eine Reihe von Größen auf, was zu einem Abstrichmuster auf Agarosegel führt. Abschließend werden die PCR-Produkte einer hochauflösenden Kapillargelelektrophorese unterzogen, gefolgt von einer Quantifizierung anhand der Größen der Poly(A)-PCR-Produkte und des genspezifischen PCR-Produkts. Diese Technik bietet ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug zur Analyse von Poly(A)-Schwanzlängen, das es uns ermöglicht, tiefere Einblicke in die komplizierten Mechanismen der mRNA-Regulation zu gewinnen.
Introduction
Die meisten eukaryotischen mRNAs werden an ihrem 3′-Terminus im Zellkern durch Zugabe von nicht-template-Adenosinen durch kanonische Poly(A)-Polymerasen posttranskriptionell polyadenyliert. Ein intakter Poly(A)-Schwanz ist während des gesamten Lebenszyklus von mRNA von entscheidender Bedeutung, da er für den mRNA-Kernexportunerlässlich ist 1, die Interaktion mit Poly(A)-bindenden Proteinen erleichtert, um die Translationseffizienz zu verbessern2, und Resistenz gegen Abbauverleiht 3. In bestimmten Fällen kann der Poly(A)-Schwanz auch im Zytoplasma gedehnt werden, was durch nicht-kanonische Poly(A)-Polymerasen erleichtert wird4. Im Zytoplasma ändert sich die Poly(A)-Schwanzlänge dynamisch und beeinflusst die Lebensdauer des mRNA-Moleküls. Zahlreiche Polymerasen und Deadenylasen sind dafür bekannt, die Schwanzlänge zu modulieren 5,6,7. Zum Beispiel korreliert die Verkürzung der Poly(A)-Schwänze mit der translationalen Repression, während die Verlängerung der Poly(A)-Schwänze die Translation verstärkt 8,9.
Zunehmende genomische Studien haben die grundlegende Bedeutung der Poly(A)-Schwanzlänge in verschiedenen Facetten der eukaryotischen Biologie gezeigt. Dazu gehören Rollen bei der Keimzellentwicklung, der frühen Embryonalentwicklung, der neuronalen synaptischen Plastizität für Lernen und Gedächtnis und der Entzündungsreaktion10. Es wurden zahlreiche Methoden und Assays zur Messung von Poly(A)-Schwanzlängen entwickelt. Beispielsweise nutzt der RNase H/Oligo(dT)-Assay die Vorteile von RNase H in Gegenwart oder Abwesenheit von Oligo(dT), um die Poly(A)-Schwanzlänge zu untersuchen11,12. Andere Methoden zur Untersuchung des Poly(A)-Schwanzes umfassen die PCR-Amplifikation von 3′-Enden, wie z. B. die schnelle Amplifikation von cDNA-Enden, den Poly(A)-Test (RACE-PAT)12,13 und den Ligase-vermittelten Poly(A)-Test (LM-PAT)14. Weitere Modifikationen des PAT-Assays umfassen ePAT15 und sPAT16. Enzymatisches G-Tailing 17,18 oder G/I-Tailing des 3′-Endes sind weitere Variationen des PAT-Assays. Eine weitere Modifikation dieser Techniken umfasst die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern zusammen mit einer Kapillargelelektrophorese für hochauflösende Analysen, die als hochauflösender Poly(A)-Test (Hire-PAT)19 bezeichnet wird. Diese PCR-gesteuerten Assays ermöglichen eine schnelle und hochempfindliche Quantifizierung der Poly(A)-Länge.
Mit der Entwicklung der Next-Generation-Sequenzierung ermöglicht eine Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode wie PAL-seq20 und TAIL-seq21 Polyadenylierungsanalysen im transkriptomweiten Maßstab. Diese Methoden liefern jedoch nur kurze Sequenzierungs-Reads von 36-51 Nukleotiden. Daher wurde FLAM-Seq22 für die globale Schwanzlängenprofilierung von mRNA in voller Länge entwickelt und bietet lange Lesevorgänge. Die Nanoporentechnologie23 bietet PCR-unabhängige, direkte RNA- oder direkte cDNA-Sequenzierung für die Schätzung der Poly(A)-Schwanzlänge. Diese Hochdurchsatzmethoden sind jedoch nicht ohne Einschränkungen. Sie benötigen große Mengen an Ausgangsmaterialien, sind teuer und zeitaufwändig. Darüber hinaus kann die Analyse seltener Transkripte mit Hochdurchsatzmethoden äußerst anspruchsvoll sein, und PCR-basierte Methoden mit niedrigem Durchsatz bieten immer noch einen Vorteil, wenn eine kleine Anzahl von Transkripten analysiert werden muss, für Pilotexperimente und die Validierung anderer Methoden.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass Dscam1-mRNAs kurze Poly(A)-Schwänze in Drosophila enthalten, was eine nicht-kanonische Bindung des zytoplasmatischen Poly(A)-bindenden Proteins an Dscam1 3’UTR unter Verwendung der G/I-Tailing-Methode24 erfordert. Hier bieten wir ein optimiertes Verfahren zur Gewebepräparation und Quantifizierung der Poly(A)-Länge von mRNAs aus dem Drosophila-Nervensystem und Drosophila-S2-Zellen .
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die Technik zur Sezierung des Drosophila-Larvengehirns aus dem wandernden 3. Stadium sowie die Probenvorbereitung aus Drosophila S2-Zellen. Aufgrund der labilen Natur von mRNAs erfordert die Probenentnahme besondere Vorsicht. Bei der Larvendissektion des Gehirns sollte das Gehirn während der Isolation nicht beschädigt und nicht über einen längeren Zeitraum in Lösung gehalten werden. Es ist wichtig, die Sezierzeit für eine Sezierrunde auf 8-10 Minuten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 an J.K. und der Cellular and Molecular Imaging Core Facility an der University of Nevada, Reno, unterstützt, die von den National Institutes of Health Grant P20GM103650 unterstützt und für die in dieser Studie berichtete Forschung verwendet wurde.
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
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