Измерение длины хвоста Poly A из головного мозга и клеточной линии личинки дрозофилы

Большинство эукариотических мРНК посттранскрипционно полиаденилированы на своем 3′-конце в ядре путем добавления нематричных аденозинов каноническими поли(А)-полимеразами. Неповрежденный поли(А)-хвост имеет решающее значение на протяжении всего жизненного цикла мРНК, поскольку он необходим для ядерного экспорта мРНК¹, облегчает взаимодействие с поли(А)-связывающими белками для повышения трансляционной эффективности² и придает устойчивость к деградации³. В некоторых случаях поли(А)-хвост также может подвергаться удлинению в цитоплазме, чему способствуют неканонические поли(А)полимеразы⁴. В цитоплазме длина поли(А)-хвоста динамически изменяется и влияет на продолжительность жизни молекулы мРНК. Известны многочисленные полимеразы и деаденилазы, модулирующие длину хвоста ^5,6,7. Например, укорочение поли(А)-хвостов коррелирует с трансляционным подавлением, тогда как удлинение поли(А)-хвостов усиливает трансляцию ^8,9.

Накопление геномных исследований продемонстрировало фундаментальное значение длины поли(А)-хвоста в различных аспектах биологии эукариот. Это включает в себя роль в развитии зародышевых клеток, раннем эмбриональном развитии, синаптической пластичности нейронов для обучения и памяти, а также воспалительной реакции¹⁰. Было разработано множество методов и анализов для измерения длины поли(А)-хвоста. Например, анализ РНКазы H/oligo(dT) использует преимущества РНКазы H в присутствии или отсутствии олиго(dT) для изучения длины поли(A) хвоста^11,12. Другие методы изучения поли(А)-хвоста включают ПЦР-амплификацию 3′-концов, такую как экспресс-амплификация поли(А) концов кДНК (RACE-PAT)^12,13 и лигаз-опосредованный поли(А) тест (LM-PAT)¹⁴. Дальнейшие модификации анализа PAT включают ePAT¹⁵ и sPAT¹⁶. Ферментативный G-хвост^17,18 или G/I-хвост 3′-конца являются другими вариантами анализа PAT. Дальнейшая модификация этих методов включает использование флуоресцентно меченных праймеров вместе с электрофорезом в капиллярном геле для анализа с высоким разрешением, называемым поли(А) тестом высокого разрешения (Hire-PAT)¹⁹. Эти ПЦР-анализы позволяют быстро и высокочувствительно количественно определить длину поли(А).

С развитием секвенирования нового поколения высокопроизводительный метод секвенирования, такой как PAL-seq²⁰ и TAIL-seq²¹, позволяет проводить анализ полиаденилирования в масштабе транскриптома. Однако эти методы обеспечивают только короткие считывания 36-51 нуклеотидов. Поэтому FLAM-Seq²² был разработан для глобального профилирования длины хвоста полноразмерной мРНК и обеспечивает длинные чтения. Технология нанопор²³ обеспечивает независимое от ПЦР прямое секвенирование РНК или прямой кДНК для оценки длины хвоста поли(А). Однако эти высокопроизводительные методы не лишены ограничений. Они требуют большого количества исходных материалов, являются дорогостоящими и трудоемкими. Кроме того, анализ редких транскриптов может быть чрезвычайно сложным при использовании высокопроизводительных методов, а низкопроизводительные методы, основанные на ПЦР, по-прежнему дают преимущество, когда необходимо проанализировать небольшое количество транскриптов, для пилотных экспериментов и валидации других методов.

Недавно мы продемонстрировали, что мРНК Dscam1 содержат короткие поли(А)-хвосты у дрозофилы, что обуславливает необходимость неканонического связывания цитоплазматического поли(А)-связывающего белка на Dscam1 3’UTR с использованием метода хвостов G/I²⁴. Здесь мы предлагаем оптимизированную процедуру подготовки тканей и количественной оценки длины поли(А) мРНК из нервной системы дрозофилы и клеток Drosophila S2.