قياس طول ذيل بولي أ من دماغ يرقة ذبابة الفاكهة وخط الخلية
Summary
يصف البروتوكول طريقة فعالة وموثوقة لتحديد طول poly(A) للجين محل الاهتمام من الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة ، والذي يمكن تكييفه بسهولة مع الأنسجة أو أنواع الخلايا من الأنواع الأخرى.
Abstract
Polyadenylation هو تعديل حاسم بعد النسخ يضيف ذيول poly (A) إلى الطرف 3 ‘من جزيئات mRNA. يتم تنظيم طول ذيل poly (A) بإحكام بواسطة العمليات الخلوية. ارتبط عدم تنظيم polyadenylation mRNA بالتعبير الجيني غير الطبيعي وأمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية وتشوهات النمو. لذلك ، فإن فهم ديناميكيات polyadenylation أمر حيوي لكشف تعقيدات معالجة mRNA وتنظيم الجينات بعد النسخ.
يقدم هذا البحث طريقة لقياس أطوال ذيل poly (A) في عينات الحمض النووي الريبي المعزولة من أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة وخلايا ذبابة الفاكهة شنايدر S2. استخدمنا نهج مخلفات جوانوزين / إينوزين (G / I) ، والذي يتضمن الإضافة الأنزيمية لبقايا G / I في نهاية 3 ‘من mRNA باستخدام بوليميراز الخميرة بولي (A). يحمي هذا التعديل نهاية الحمض النووي الريبي 3 ‘من التدهور الأنزيمي. ثم يتم نسخ ذيول poly (A) المحمية كاملة الطول بشكل عكسي باستخدام طبقة أولية عالمية مضادة للحساسية. بعد ذلك ، يتم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام oligo خاص بالجين يستهدف الجين محل الاهتمام ، جنبا إلى جنب مع oligo تسلسل عالمي يستخدم للنسخ العكسي.
هذا يولد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تشمل ذيول بولي (أ) للجين محل الاهتمام. نظرا لأن polyadenylation ليس تعديلا موحدا وينتج عنه ذيول بأطوال متفاوتة ، فإن منتجات PCR تعرض مجموعة من الأحجام ، مما يؤدي إلى نمط تشويه على هلام الأغاروز. أخيرا ، تخضع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للرحلان الكهربائي للهلام الشعري عالي الدقة ، يليه القياس الكمي باستخدام أحجام منتجات poly (A) PCR ومنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالجينات. توفر هذه التقنية أداة مباشرة وموثوقة لتحليل أطوال ذيل poly (A) ، مما يمكننا من اكتساب رؤى أعمق حول الآليات المعقدة التي تحكم تنظيم mRNA.
Introduction
معظم mRNAs حقيقية النواة هي polyadenylated بعد النسخ في نهايتها 3 ′ في النواة عن طريق إضافة الأدينوزينات غير المقولبة بواسطة بوليميراز بولي (A) الكنسي. يعد ذيل poly (A) السليم محوريا طوال دورة حياة mRNA ، لأنه ضروري لتصدير mRNAالنووي 1 ، ويسهل التفاعل مع البروتينات المرتبطة ب poly (A) لتعزيز الكفاءة الانتقالية2 ، ويضفي مقاومة ضد التدهور3. في بعض الحالات، يمكن أن يخضع ذيل بولي (أ) أيضا للتمدد في السيتوبلازم، الذي تسهله بوليميراز بولي (أ) غير المتعارف عليه4. في السيتوبلازم ، يتغير طول ذيل بولي (A) ديناميكيا ويؤثر على العمر الافتراضي لجزيء mRNA. تشتهر العديد من البلمرة و deadenylases بتعديل طول الذيل5،6،7. على سبيل المثال ، يرتبط تقصير ذيول poly (A) بالقمع الانتقالي ، في حين أن إطالة ذيول poly (A) تعزز الترجمة 8,9.
أظهرت الدراسات الجينومية المتراكمة الأهمية الأساسية لطول ذيل poly (A) عبر جوانب مختلفة من بيولوجيا حقيقية النواة. وهذا يشمل الأدوار في تطوير الخلايا الجرثومية ، والتطور الجنيني المبكر ، واللدونة العصبية المشبكية للتعلم والذاكرة ، والاستجابة الالتهابية10. تم تطوير العديد من الطرق والمقايسات لقياس أطوال ذيل poly (A). على سبيل المثال ، يستفيد اختبار RNase H / oligo (dT) من RNase H في وجود أو عدم وجود oligo (dT) لدراسة طول ذيل poly (A)11,12. تشمل الطرق الأخرى لدراسة ذيل poly (A) تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لنهايات 3 بوصات مثل التضخيم السريع لنهايات cDNA اختبار poly (A) (RACE-PAT) 12،13 واختبار poly (A) بوساطة ligase (LM-PAT) 14. تشمل التعديلات الإضافية لمقايسة PAT ePAT15 و sPAT16. الأنزيمية G-tailing17,18 أو G / I-tailing من نهاية 3 ‘هي اختلافات أخرى في فحص PAT. يتضمن التعديل الإضافي لهذه التقنيات استخدام البادئات ذات العلامات الفلورية جنبا إلى جنب مع الرحلان الكهربائي للهلام الشعري للتحليل عالي الدقة ، والذي يشار إليه باسم اختبار poly (A) عالي الدقة (Hire-PAT) 19. تسمح هذه المقايسات التي تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل بتحديد كمية طول بولي (أ) بسرعة وعالية الحساسية.
مع تطوير تسلسل الجيل التالي ، تسمح طريقة التسلسل عالية الإنتاجية ، مثل PAL-seq20 و TAIL-seq21 ، بتحليلات polyadenylation على نطاق واسع للنسخ. ومع ذلك ، توفر هذه الطرق قراءات تسلسل قصيرة فقط من 36-51 نيوكليوتيدات. لذلك ، تم تطوير FLAM-Seq22 لتحديد طول الذيل العالمي ل mRNA كامل الطول ويوفر قراءات طويلة. توفر تقنية Nanopore23 تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر المستقل عن تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تسلسل cDNA المباشر لتقديرات طول الذيل poly (A). ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب عالية الإنتاجية لا تخلو من القيود. إنها تتطلب كميات كبيرة من المواد الأولية ، وهي باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون تحليل النصوص النادرة أمرا صعبا للغاية مع الطرق عالية الإنتاجية ، ولا تزال الطرق منخفضة الإنتاجية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل توفر ميزة عندما يحتاج عدد صغير من النصوص إلى التحليل ، لإجراء تجارب تجريبية ، والتحقق من صحة الطرق الأخرى.
لقد أثبتنا مؤخرا أن Dscam1 mRNAs تحتوي على ذيول بولي (A) قصيرة في ذبابة الفاكهة ، مما يستلزم ارتباطا غير قانوني للبروتين المرتبط بالسيتوبلازم poly (A) على Dscam1 3’UTR باستخدام طريقة المخلفات G / I24. نقدم هنا إجراء مبسطا لإعداد الأنسجة وتحديد طول poly (A) من mRNAs من الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة وخلايا ذبابة الفاكهة S2.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، نصف تقنية تشريح دماغ يرقات ذبابة الفاكهة من تجول3 المرحلة الداخلية بالإضافة إلى تحضير العينة من خلايا ذبابة الفاكهة S2. نظرا للطبيعة المرنة ل mRNAs ، يتطلب جمع العينات مزيدا من الحذر. بالنسبة لتشريح دماغ اليرقات ، يجب عدم تلف الأدمغة أثناء العزلة ويجب عدم ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية R01NS116463 إلى JK ، ومرفق التصوير الخلوي والجزيئي الأساسي في جامعة نيفادا ، رينو ، والذي تم دعمه من قبل المعاهد الوطنية للصحة Grant P20GM103650 واستخدامها للبحث المذكور في هذه الدراسة.
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression – Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O’Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3′ RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3′-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3′ end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects’ RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3′ UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3′ trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
