Medição do comprimento da cauda de Poly A do cérebro da larva de Drosophila e da linha celular
Summary
O protocolo descreve um método eficiente e confiável para quantificar o comprimento poli(A) do gene de interesse do sistema nervoso de Drosophila , que pode ser facilmente adaptado a tecidos ou tipos celulares de outras espécies.
Abstract
A poliadenilação é uma modificação pós-transcricional crucial que adiciona caudas de poli(A) à extremidade 3′ das moléculas de RNAm. O comprimento da cauda poli(A) é fortemente regulado por processos celulares. A desregulação da poliadenilação de RNAm tem sido associada à expressão gênica anormal e a várias doenças, incluindo câncer, distúrbios neurológicos e anormalidades do desenvolvimento. Portanto, compreender a dinâmica da poliadenilação é vital para desvendar as complexidades do processamento de RNAm e da regulação gênica pós-transcricional.
Este trabalho apresenta um método para medir o comprimento da cauda de poli(A) em amostras de RNA isoladas de cérebros de larvas de Drosophila e células S2 de Drosophila Schneider. Empregamos a abordagem de rejeito de guanosina/inosina (G/I), que envolve a adição enzimática de resíduos de G/I na extremidade 3′ do RNAm usando poli(A) polimerase de levedura. Esta modificação protege a extremidade 3′ do RNA da degradação enzimática. As caudas poli(A) de comprimento total protegidas são então transcritas reversamente usando um primer antisenso universal. Posteriormente, a amplificação por PCR é realizada usando um oligo gene-específico que tem como alvo o gene de interesse, juntamente com uma sequência universal oligo usada para transcrição reversa.
Isso gera produtos de PCR englobando as caudas poli(A) do gene de interesse. Como a poliadenilação não é uma modificação uniforme e resulta em caudas de comprimentos variados, os produtos de PCR exibem uma variedade de tamanhos, levando a um padrão de esfregaço no gel de agarose. Finalmente, os produtos de PCR são submetidos à eletroforese em gel capilar de alta resolução, seguida de quantificação usando os tamanhos dos produtos de poli(A) PCR e do produto de PCR gene-específico. Esta técnica oferece uma ferramenta simples e confiável para analisar comprimentos de cauda poli(A), permitindo-nos obter insights mais profundos sobre os intrincados mecanismos que governam a regulação do RNAm.
Introduction
A maioria dos mRNAs eucarióticos são pós-transcricionalmente poliadenilados, em seu término 3′ no núcleo, pela adição de adenosinas não moldadas por poli(A) polimerases canônicas. Uma cauda poli(A) intacta é fundamental durante todo o ciclo de vida do mRNA, pois é essencial para a exportação nuclear de mRNA1, facilita a interação com proteínas ligadoras de poli(A) para aumentar a eficiência translacional2 e confere resistência contra a degradação3. Em certos casos, a cauda de poli(A) também pode sofrer extensão no citoplasma, facilitada por poli(A) polimerases nãocanônicas4. No citoplasma, o comprimento da cauda do poli(A) muda dinamicamente e influencia o tempo de vida da molécula de RNAm. Numerosas polimerases e deadenilases são conhecidas por modular o comprimento da cauda 5,6,7. Por exemplo, o encurtamento das caudas poli(A) correlaciona-se com a repressão translacional, enquanto o alongamento das caudas poli(A) aumenta a tradução 8,9.
Estudos genômicos acumulados têm demonstrado a importância fundamental do comprimento da cauda poli(A) em várias facetas da biologia eucariótica. Isso inclui papéis no desenvolvimento de células germinativas, desenvolvimento embrionário inicial, plasticidade sináptica neuronal para aprendizagem e memória, e a resposta inflamatória10. Existem inúmeros métodos e ensaios desenvolvidos para medir o comprimento da cauda do poli(A). Por exemplo, o ensaio RNase H/oligo(dT) aproveita a RNase H na presença ou ausência de oligo(dT) para estudar o comprimento da cauda do poli(A)11,12. Outros métodos para estudar a cauda poli(A) incluem a amplificação por PCR das extremidades 3′, como o teste de amplificação rápida das extremidades do cDNA poli(A) (RACE-PAT)12,13 e o teste poli(A) mediado por ligase (LM-PAT)14. Outras modificações do ensaio PAT incluem ePAT15 e sPAT16. A cauda G enzimática17,18 ou a cauda G/I da extremidade 3′ são outras variações do ensaio PAT. Outras modificações dessas técnicas incluem o uso de primers fluorescentemente marcados juntamente com eletroforese em gel capilar para análise de alta resolução, conhecido como teste de poli(A) de alta resolução (Hire-PAT)19. Estes ensaios conduzidos por PCR permitem a quantificação rápida e de alta sensibilidade do comprimento poli(A).
Com o desenvolvimento do sequenciamento de última geração, um método de sequenciamento de alto rendimento, como o PAL-seq20 e o TAIL-seq21, permite análises de poliadenilação em escala de transcriptoma. No entanto, esses métodos fornecem apenas leituras curtas de sequenciamento de 36-51 nucleotídeos. Portanto, o FLAM-Seq22 foi desenvolvido para o perfil global do comprimento da cauda do mRNA de comprimento total e fornece leituras longas. A tecnologia de nanoporos23 fornece sequenciamento direto de RNA ou cDNA independente de PCR para estimativas do comprimento da cauda de poli(A). No entanto, esses métodos de alto rendimento não são isentos de limitações. Eles exigem grandes quantidades de materiais de partida, são caros e demorados. Além disso, a análise de transcrições raras pode ser extremamente desafiadora com métodos de alto rendimento, e métodos baseados em PCR de baixo rendimento ainda fornecem uma vantagem quando um pequeno número de transcritos precisa ser analisado, para experimentos piloto e validação de outros métodos.
Recentemente, demonstramos que os mRNAs de Dscam1 contêm caudas curtas de poli(A) em Drosophila, o que requer uma ligação não canônica da proteína de ligação citoplasmática poli(A) em Dscam1 3’UTR usando o método de rejeito G/I24. Aqui nós fornecemos um procedimento simplificado para a preparação de tecidos e quantificação do comprimento poli(A) de mRNAs do sistema nervoso Drosophila e células Drosophila S2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos a técnica para dissecar o cérebro de larvas de Drosophila do estágio errante de3º ínstar, bem como a preparação de amostras de células de Drosophila S2. Devido à natureza lábil dos mRNAs, a coleta de amostras requer cuidado extra. Para a dissecção cerebral larval, os cérebros não devem ser danificados durante o isolamento e não devem ser mantidos em solução por um período prolongado. Manter o tempo de dissecção para 8-10 min para uma rodada de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Stroke Grant R01NS116463 a J.K., e a instalação do núcleo de imagem celular e molecular na Universidade de Nevada, Reno, que foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant P20GM103650 e usado para a pesquisa relatada neste estudo.
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression – Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O’Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3′ RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3′-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3′ end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects’ RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3′ UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3′ trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
