ショウジョウバエ幼虫の脳および細胞株からのPoly A尾長の測定
Summary
プロトコルは他の種からのティッシュかセルのタイプに容易に合わせることができる ショウジョウバエ の神経系からの興味の遺伝子の多(A)長さを量化するための有効で、信頼できる方法を記述する。
Abstract
ポリアデニル化は、mRNA分子の3’末端にポリ(A)テールを付加する重要な転写後修飾です。ポリ(A)テールの長さは、細胞プロセスによって厳密に制御されています。mRNAポリアデニル化の調節不全は、遺伝子発現の異常や、がん、神経疾患、発達異常などのさまざまな疾患と関連しています。したがって、ポリアデニル化の動態を理解することは、mRNAプロセシングと転写後遺伝子制御の複雑さを解明するために不可欠です。
この論文では、 ショウジョウバエ の幼虫の脳と ショウジョウバエ のシュナイダーS2細胞から単離されたRNAサンプルのポリ(A)テールの長さを測定する方法を紹介します。私たちは、酵母ポリ(A)ポリメラーゼを用いてmRNAの3’末端にG/I残基を酵素的に付加するグアノシン/イノシン(G/I)テーリングアプローチを採用しました。この修飾により、RNAの3’末端が酵素分解から保護されます。次に、保護された全長のポリ(A)テールを、ユニバーサルアンチセンスプライマーを使用して逆転写します。続いて、逆転写に用いるユニバーサル配列オリゴとともに、目的遺伝子を標的とする遺伝子特異的オリゴを用いてPCR増幅を行う。
これにより、目的の遺伝子のポリ(A)テールを包含するPCR産物が生成されます。ポリアデニル化は均一な修飾ではなく、さまざまな長さのテールが生じるため、PCR産物はさまざまなサイズを示し、アガロースゲルに塗抹標本パターンをもたらします。最後に、PCR産物を高分解能キャピラリーゲル電気泳動にかけ、ポリ(A)PCR産物と遺伝子特異的PCR産物のサイズを用いて定量します。この手法は、ポリ(A)テールの長さを分析するための簡単で信頼性の高いツールを提供し、mRNA制御を支配する複雑なメカニズムについてより深い洞察を得ることができます。
Introduction
ほとんどの真核生物のmRNAは、標準的なポリ(A)ポリメラーゼによる非テンプレート化アデノシンの付加により、核内の3’末端で転写後ポリアデニル化されます。無傷のポリ(A)テールは、mRNAの核外輸送に不可欠であり1、ポリ(A)結合タンパク質との相互作用を促進して翻訳効率を高め2、分解に対する耐性を付与する3ため、mRNAのライフサイクル全体を通じて極めて重要です。場合によっては、ポリ(A)テールは、非標準的ポリ(A)ポリメラーゼによって促進され、細胞質内で伸長することもあります4。細胞質では、ポリ(A)テールの長さが動的に変化し、mRNA分子の寿命に影響を与えます。多数のポリメラーゼおよびデデニラーゼは尾の長さ5,6,7を調節するために知られている。例えば、ポリ(A)テールの短縮は並進抑制と相関し、ポリ(A)テールの延長は並進抑制を増強する8,9。
蓄積されたゲノム研究は、真核生物生物学のさまざまな側面にわたるポリ(A)尾の長さの基本的な重要性を実証しました。これには、生殖細胞の発生、初期胚発生、学習と記憶のためのニューロンシナプス可塑性、および炎症反応における役割が含まれます10。ポリ(A)テールの長さを測定するために開発された方法は数多くあります。例えば、RNase H/oligo(dT)アッセイでは、オリゴ(dT)の存在下または非存在下でのRNase Hを利用して、ポリ(A)テール長11,12を研究します。ポリ(A)テールを研究する他の方法には、cDNA末端の迅速増幅などの3’末端のPCR増幅、ポリ(A)テスト(RACE-PAT)12,13、リガーゼ媒介ポリ(A)テスト(LM-PAT)14などがあります。PATアッセイのさらなる修飾には、ePAT15およびsPAT16が含まれる。酵素的Gテーリング17,18または3’末端のG/Iテーリングは、PATアッセイの他のバリエーションです。これらの技術のさらなる修正には、高分解能ポリ(A)テスト(Hire-PAT)と呼ばれる高分解能分析のためのキャピラリーゲル電気泳動とともに蛍光標識されたプライマーの使用が含まれます19。これらのPCR駆動アッセイにより、ポリ(A)長の定量を迅速かつ高感度に行うことができます。
次世代シーケンシングの開発に伴い、PAL-seq20 やTAIL-seq21などのハイスループットシーケンシング法により、トランスクリプトームワイドスケールでのポリアデニル化解析が可能になりました。しかしながら、これらの方法は、36〜51ヌクレオチドの短い配列リードしか提供しない。そのため、FLAM-Seq22 は、完全長mRNAのグローバルテール長プロファイリング用に開発され、ロングリードを提供します。ナノポアテクノロジー23 は、ポリ(A)テール長の推定のために、PCRに依存しない直接RNA、または直接cDNAシーケンシングを提供します。ただし、これらのハイスループット方法には制限がないわけではありません。大量の出発物質を必要とし、高価で時間がかかります。さらに、希少な転写産物の解析は、ハイスループットの方法では非常に困難な場合があり、ロースループットのPCRベースの分析法は、パイロット実験や他の方法の検証のために、少数の転写産物を解析する必要がある場合に利点を提供します。
我々は最近、ショウジョウバエにおいてDscam1 mRNAが短いポリ(A)テールを含むことを実証し、G/Iテーリング法を用いてDscam1 3’UTR上の細胞質ポリ(A)結合タンパク質の非標準的結合を必要とすることを明らかにした24。ここでは、ショウジョウバエの神経系およびショウジョウバエS2細胞由来のmRNAの組織調製とポリ(A)長の定量化のための合理化された手順を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、私達はショウジョウバエS2セルからのサンプル準備と同様、第3のinstarの段階をさまようことからのショウジョウバエの幼虫の頭脳を解剖する技術を記述する。mRNAは不安定な性質を持っているため、サンプル採取には特別な注意が必要です。幼虫の脳解剖の場合、隔離中に脳が損傷してはならず、長期間溶液中に保管しないでください。解剖のラウ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 to J.K.)と、国立衛生研究所(National Institutes of Health Grant P20GM103650)の支援を受けたネバダ大学リノ校の細胞・分子イメージングコア施設の支援を受けて、本研究で報告された研究に使用されました。
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
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