إكس فيفو زراعة الخلايا السرطانية المنتشرة في السائل الشوكي الدماغي من مرضى سرطان الجلد لدراسة مرض Leptomeningeal المرتبط بسرطان الجلد
Summary
توضح هذه المقالة بروتوكولا لانتشار الخلايا السرطانية المنتشرة في السائل النخاعي الدماغي (CSF-CTCs) التي تم جمعها من المرضى الذين يعانون من مرض Leptomeningeal المرتبط بالورم الميلانيني (M-LMD) لتطوير نماذج ما قبل السريرية لدراسة M-LMD.
Abstract
يحدث مرض الليبتومينينج المرتبط بالورم الميلانيني (M-LMD) عندما تدخل الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) إلى السائل النخاعي الدماغي (CSF) وتستعمر السحايا ، وهي طبقات الغشاء التي تحمي الدماغ والحبل الشوكي. بمجرد إنشائها ، يكون تشخيص مرضى M-LMD كئيبا ، حيث يتراوح معدل البقاء على قيد الحياة بشكل عام من أسابيع إلى شهور. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى ندرة فهمنا للمرض ، ونتيجة لذلك ، توافر خيارات العلاج الفعالة. سيؤدي تحديد البيولوجيا الأساسية ل M-LMD إلى تحسين القدرة بشكل كبير على تكييف العلاجات المتاحة لعلاج M-LMD أو تصميم مثبطات جديدة لهذا المرض القاتل عالميا. ومع ذلك ، يكمن العائق الرئيسي في الحصول على كميات كافية من CTCs من CSF المشتق من المريض (CSF-CTCs) لإجراء تجارب ما قبل السريرية ، مثل التوصيف الجزيئي والتحليل الوظيفي ودراسات الفعالية في الجسم الحي . كما ثبت أن زراعة CSF-CTCs خارج الجسم الحي يمثل تحديا. لمعالجة هذا الأمر ، تم تطوير بروتوكول جديد لثقافة M-LMD CSF-CTCs المشتقة من المريض خارج الجسم الحي وفي الجسم الحي . تم العثور على دمج الوسائط المشروطة التي تنتجها الخلايا السحائية البشرية (HMCs) لتكون حاسمة لهذا الإجراء. يكشف تحليل مصفوفة السيتوكين أن العوامل التي تنتجها HMCs ، مثل البروتينات المرتبطة بعامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGFBPs) وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية A (VEGF-A) ، مهمة في دعم بقاء CSF-CTC خارج الجسم الحي. هنا ، تظهر فائدة خطوط CSF-CTC المعزولة المشتقة من المريض في تحديد فعالية المثبطات التي تستهدف عامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGF) ومسارات إشارات البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK). بالإضافة إلى ذلك ، تظهر القدرة على تلقيح هذه الخلايا داخل الجسم الحي لإنشاء نماذج الفئران من M-LMD التي يمكن استخدامها للاختبار قبل السريري للعلاجات المعتمدة أو الجديدة. يمكن أن تساعد هذه الأدوات في كشف البيولوجيا الأساسية التي تقود إنشاء CSF-CTC في السحايا وتحديد علاجات جديدة لتقليل المراضة والوفيات المرتبطة ب M-LMD.
Introduction
يحدث مرض Leptomeningeal (LMD) عندما تنتشر الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) في السائل النخاعي الدماغي (CSF) وتؤسس في السحايا الغشاء المحيط بالدماغ والحبل الشوكي 1,2. يمكن أن يحدث LMD في العديد من أنواع السرطان ولكنه منتشر بشكل خاص في سرطان الجلد. في المراحل المتقدمة من سرطان الجلد ، سيصاب ما يقرب من 5٪ من المرضى بسرطان الجلد المرتبط ب M-LMD 2,3. في حين أن عواقب M-LMD منخفضة نسبيا فيما يتعلق بمواقع ورم خبيث أخرى ، إلا أنها مدمرة ، حيث يتراوح معدل البقاء على قيد الحياة بشكل عام من أسابيع إلى أشهر ، وهو مساهم كبير في مراضة المرضى1،3،4. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى ندرة خيارات العلاج الفعالة جنبا إلى جنب مع الثغرات الكبيرة في معرفتنا فيما يتعلق بكيفية استعمار خلايا سرطان الجلد2. لذلك ، فإن فهم بيولوجيا M-LMD سيسهل تصميم علاجات جديدة لتحسين النتائج السريرية.
وقد أظهرت التقارير الأخيرة كيف تستعمر رابع كلوريد الكربون البيئة المكروية الفريدة للعامل الدماغي النخاعي. على سبيل المثال ، يعزز Complement C3 غزو الخلايا السرطانية إلى السائل الدماغي الشوكي عبر الضفيرة المشيمية ، وهي شبكة معقدة من الأوعية الدموية في كل بطين من الدماغ5. علاوة على ذلك ، استجابة للمغذيات الدقيقة النادرة في السائل الدماغي الشوكي ، يمكن ل CTCs تنظيم ليبوكالين -2 ، وهو بروتين كاسح للحديد ، ومستقبلاته SLC22A17 لتعزيز البقاء على قيد الحياة6. باستخدام التحليلات القائمة على omic ل CSF ، وجدت مجموعتنا أيضا أن السائل الدماغي الشوكي غني بالبروتينات التي تنظم إشارات عامل النمو الشبيه بالأنسولين (IGF) ، بالإضافة إلى المناعة الفطرية3. تؤكد هذه البيانات معا على قيمة CSF-CTCs من الخزعات السائلة لدراسة M-LMD.
في حين يمكن في بعض الأحيان تحديد CSF-CTCs عن طريق أخذ عينات من السائل الدماغي الشوكي للمريض عن طريق البزل القطني أو خزان Ommaya أو التشريح السريع ، فإن أحد القيود الرئيسية هو الحصول على أعداد كافية من هذه الخلايا النادرة والهشة 1,7. على سبيل المثال ، باستخدام تقنية تعداد CTC ، لا يمكن التعرف إلا على عدة مئات إلى عدة آلاف من الخلايا السرطانية لكل عينة CSF7 للمريض ، مما يجعل من الصعب إجراء التحليلات الجزيئية والوظيفية في المختبر أو في الجسم الحي. على الرغم من وجود تقارير عن النجاح في نمو CTCs لفترة وجيزة خارج الجسم الحي من الدم المحيطي (أي CTCs لسرطان الثدي)8،9،10 ، فإن هذه الخلايا عادة ما تنمو فقط على المدى القصير ، ولم يتم الإبلاغ عن أي حالات من القدرة على نمو سرطان الجلد CTCs في السائل الدماغي الشوكي. وبالتالي ، فإن إيجاد طرق لنشر سرطان الجلد CSF-CTCs ، أو CTCs بشكل عام ، سيكون مفيدا للغاية لدراسة بيولوجيا M-LMD 7,11.
لأول مرة ، تم وصف تقنية جديدة لنشر CSF-CTCs من مرضى M-LMD خارج الجسم الحي . هنا في هذا التقرير ، تم تطوير بروتوكول مفصل يسمح بزراعة وتوسيع CSF-CTCs من مرضى M-LMD. نظرا لأن السحايا تفرز مجموعة متنوعة من عوامل النمو مثل FGF و IGF و VEGF-A و IGFBPs التي تدعم النمو المحيط ببيئتها12،13،14،15،16 ، فقد تم ترشيد أن CSF-CTCs قد تتطلب هذه المكونات للنمو في ظروف خارج الجسم الحي . لذلك ، يستخدم هذا البروتوكول وسائط مشروطة تم إنشاؤها عن طريق زراعة الخلايا السحائية البشرية – (HMCs-) في المختبر. بالنسبة للتلقيح في الجسم الحي ، يتم تلقيح الخلايا المشتقة من المريض في الفئران التي تعاني من نقص المناعة لتوليد خطوط CSF-CTCs المشتقة من المريض (PD-CSF-CTCs). إن توافر خلايا M-LMD المشتقة من المريض سيدعم المقايسات الخلوية والجزيئية والوظيفية لدراسة M-LMD واقتراح استراتيجيات علاج جديدة لهذا المرض الفتاك.
Protocol
Representative Results
Discussion
M-LMD هو مرض مدمر ومميت عالميا ، وهناك حاجة ملحة لإيجاد استراتيجيات علاج أفضل. أحد العوائق الرئيسية لدراسة M-LMD هو عدم القدرة على الحصول على ما يكفي من CSF-CTCs لإجراء الدراسات الجزيئيةوالوظيفية 1,7. على الرغم من وجود طرق حالية لزراعة CTCs من الدم المحيطي و CSF لأنواع السرطان الأخرى ، مثل سرطان الثدي والمبيض11،31،32 ، فإن طرق انتشار CTC هذه عادة ما تكون قصيرة الأجل ، ولم يتم الإبلاغ عن نجاح في زراعة CSF-CTCs من سرطان الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المنهجيات الحالية لنشر CTCs موجودة في إعدادات قصيرة الأجل خارج الجسم الحي ولم تسفر بعد عن نموذج LMD في الجسم الحي مشتق من خلايا LMD المريضة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول جديد لزراعة هذه الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي ، مما يؤدي إلى خطوط خلايا فريدة مشتقة من المريض. حاليا ، من بين 11 مريضا من M-LMD في الدراسة ، كانت هناك فرصة 60٪ تقريبا (7 من 11) للنجاح في نشر M-LMD CSF-CTCs في المختبر ، وبينما تم تخفيض هذا إلى ~ 20٪ (2 من 11) في الجسم الحي باستخدام طريقة CDX7.
من الواضح أن الظروف في المختبر لا تلخص البيئة المكروية CSF. ومع ذلك ، فقد تم تنفيذ النهج البروتينية سابقا لدراسة مكونات البروتين في السائل الدماغي الشوكي وقدمت بعض الأفكار حول العوامل الرئيسية التي كانت مطلوبة لنمو CTC خارج الجسم الحي3. على سبيل المثال ، تم تحديد أن أحد المسارات الرئيسية التي تعزز بقاء CTC في مرضى M-LMD كان مرتبطا بالأنشطة المتزايدة المتعلقة ب IGF 3,7. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات أن leptomeninges تفرز مجموعة متنوعة من السيتوكينات / عوامل النمو في السائل الدماغي الشوكي ، بما في ذلك FGF-2 و EGF و GM-CSF والبروتينات المتعلقة بإشارات IGF12. في الواقع ، تم تلخيص ذلك في وسائل الإعلام المثقفة مع HMCs ، مما يدعم الدور المحتمل لعوامل النمو هذه في تعزيز نمو CSF-CTC.
تتمثل الميزة الرئيسية في إنشاء نموذج PDX (أو CDX) في القدرة على اكتساب رؤى أعمق في أمراض المرض ، وهو أمر تفتقر إليه الظروف في المختبر . من الناحية المثالية ، يفضل اتباع نهج PDX لأن CSF-CTCs ستكون مباشرة من المرضى الذين ليس لديهم زراعة خارج الجسم الحي . في البداية ، بذلت محاولات لإنشاء M-LMD باستخدام هذا النهج ، لكنها لم تنجح حتى الآن. من المحتمل أن ترتبط صعوبة توليد فئران PDX بوفرة وسلامة المواد الأولية (أي عدد قليل جدا من CTCs القابلة للحياة في السائل الدماغي الشوكي للمريض عند الجمع الروتيني في العيادة). قد يفسر هذا سبب نجاحنا المتفوق في نمو CTCs من CSF الذي تم جمعه في تشريح الجثة7. لزيادة احتمال الانتشار في الجسم الحي ، تم تعديل هذا البروتوكول لتوفير نهج CDX بديل. يمكن توسيع CSF-CTCs أولا في المختبر (الخطوة 3) لإنشاء خطوط PD-CSF-CTC التي تتمتع بإمكانات نمو طويلة الأجل وأكبر. ثم يتم تلقيح هذه الخلايا في الفئران لإنشاء M-LMD. على الرغم من أن الطريقة الحالية ولدت عددا محدودا من نماذج CDX M-LMD (~ 20٪) في الجسم الحي ، إلا أن هذا قد يعكس التنوع النسخي ل CSF-CTCs ، وتعقيد البيئة المكروية CSF ، وصعوبة زراعة هذه الخلايا بشكل عام. نحن نفترض أن التطوير المستقبلي لنموذج فأر متوافق مع البشر قد يعزز معدل نجاح النقش نظرا لأهمية البيئة المكروية في دعم بقاء الخلايا السرطانية33.
يتمثل أحد قيود نهج CDX في أنه تم اختيار بعض المستنسخة فقط من عينات المرضى ، وقد لا يعكس الانجراف الجيني للخلايا السرطانية من خلال الزراعة خارج الجسم الحي ملف النسخ للمصدر الأصلي. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أنه على الرغم من الزراعة في المختبر ، احتفظت خطوط PD-CSF-CTC بحوالي 97٪ من تشابه التعبير الجيني مع مرضى CSF-CTCs7 المعزولين وغير المزروعين. في تلك الدراسة ، كشفت تحليلات scRNA-seq عن تداخل التوقيعات الجينية المخصبة بين PD-CSF-CTCs غير المزروعة في المختبر وفي الجسم الحي PD-CSF-CTCs ، مثل SOX9 و ErbB3 و IGF-1R7 ، مما يشير إلى أن هذه قد تكون أهدافا علاجية محتملة. بالإضافة إلى ذلك ، تشارك هذه الجينات المخصبة بشكل شائع في المسارات البيولوجية المرتبطة بتنظيم النسخ والتمثيل الغذائي7. بشكل جماعي ، يسلط هذا الضوء على القيمة الانتقالية لثقافات PD-CSF-CTC لفهم بيولوجيا M-LMD بشكل أفضل ، وتحديد الآليات والمسارات الجزيئية المستهدفة التي تقود المرض ، وتصميم علاجات عقلانية في الدراسات المستقبلية.
على الرغم من أن المنهجية الحالية لا تزال غير كاملة ، حيث لا توجد طريقة لتحديد مسبق لحالة وصلاحية CSF-CTCs في مرضى M-LMD ، فقد تم إجراء العديد من الملاحظات التي من شأنها أن تزيد من احتمال النجاح لأن CTCs منخفضة العدد وهشة للغاية. وتشمل هذه الخطوات الحاسمة التنسيق مع العيادة لوضع عينات السائل الدماغي الشوكي على الثلج بمجرد سحبها ونقلها بسرعة إلى المختبر للحفاظ على سلامة الخلايا. بعد ذلك ، يجب معالجة CSF-CTCs على الفور ، إما عن طريق طلائها في الثقافة أو حفظ الخلايا بالتبريد.
بشكل عام ، كانت زراعة وتوسيع CSF-CTCs عملية تجربة وخطأ ، لكن إنشاء هذا البروتوكول لتوليد خلايا M-LMD المشتقة من المريض سيمنح الباحثين الموارد اللازمة لإجراء تجارب على عينات المرضى ، والتي لم يكن من الممكن القيام بها من قبل. يتمثل أحد الأهداف الرئيسية للمضي قدما في استخدام M-LMD PD-CSF-CTCs لإجراء التوصيف الجزيئي ، وفحص الأدوية عالي الإنتاجية ، ودراسات فعالية الأدوية في الجسم الحي لتصميم علاجات عقلانية لعلاج M-LMD. ويعتقد أن هذا النهج سيؤدي إلى استراتيجيات علاجية من شأنها أن تقلل بشكل كبير من المراضة والوفيات المرتبطة بهذا الجانب المميت حاليا من سرطان الجلد النقيلي المتقدم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر المرضى والعائلات على كرمهم الاستثنائي في التبرع بالأنسجة لهذه الدراسة العلمية. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة منح P50 CA168536 و R21 CA256289 و R21 CA216756 (إلى KSMS و PAF) K99 CA226679 (إلى IS). صندوق تسريع أبحاث مؤسسة موفيت (إلى BC و PAF) ، برنامج موفيت للبيولوجيا الكيميائية والطب الجزيئي (PAF و DD) ، مؤسسة موفيت (PAF). يتم دعم الجينوم الجزيئي والأنسجة والمعلوماتية الحيوية والإحصاء الحيوي في Moffitt جزئيا من قبل المعهد الوطني للسرطان من خلال منحة دعم مركز السرطان (P30-CA076292) ومؤسسة موفيت.
Materials
| 1 mL syringe 27 – 29 G needles | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile Filtered |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Any vendor | ||
| 15 ml and 50 mL polystyrene centrifuge tubes | Any vendor | n/a | |
| 6 - 8 weeks females NOD SCID gamma (NSG) mice | Charles River | Males optional | |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ScienCell | #0010 | |
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100ml | 30 G for cisterna magna injection |
| Human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Milipore Sigma (or any vender) | #F0291 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Milipore Sigma (or any vender) | #SRP3027 | |
| Human meningeal cells (HMCs) isolated from human leptomeninges | ScienCell | #1400 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Meningeal Cell Culture Media (MenCM) | ScienCell | #1401 | |
| Meningeal cell growth supplement (MCGS) | ScienCell | #1452 | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| P1000, P200, P20 pipettes/ pipette tips | |||
| penicillin-streptomycin Antibiotic solution | ScienCell (or any vender) | #0503 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile Filtered |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Screw cap cryo tubes | |||
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a | |
| Tissue culture plates/flasks (96-well, 24-well, 12-well, 6-well, T175 etc.) |
References
- Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell Melanoma Res. 33 (4), 527-541 (2020).
- Khaled, M. L., Tarhini, A. A., Forsyth, P. A., Smalley, I., Pina, Y. Leptomeningeal disease (LMD) in patients with melanoma metastases. Cancers (Basel). 15 (6), 1884 (2023).
- Smalley, I., et al. Proteomic analysis of CSF from patients with leptomeningeal melanoma metastases identifies signatures associated with disease progression and therapeutic resistance). Clin Cancer Res. 26 (9), 2163-2175 (2020).
- Larkin, J., et al. Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 381, 1535-1546 (2019).
- Boire, A., et al. Complement component 3 adapts the cerebrospinal fluid for leptomeningeal metastasis. Cell. 168 (6), 1101-1113 (2017).
- Chi, Y., et al. Cancer cells deploy lipocalin-2 to collect limiting iron in leptomeningeal metastasis. Science. 369 (6501), 276-282 (2020).
- Law, V., et al. A preclinical model of patient-derived cerebrospinal fluid circulating tumor cells for experimental therapeutics in leptomeningeal disease from melanoma. Neuro Oncol. 24 (10), 1673-1686 (2022).
- Carmona-Ule, N., et al. Short-term ex vivo culture of CTCs from advance breast cancer patients: Clinical implications. Cancers (Basel). 13 (11), 2668 (2021).
- Zhang, L., et al. The identification and characterization of breast cancer CTCs competent for brain metastasis. Sci Transl Med. 5 (180), (2013).
- Yu, M., et al. Cancer therapy: Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
- Mohamed, B. M., et al. Ex vivo expansion of circulating tumour cells (CTCs). Sci Rep. 13 (1), 3704 (2023).
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: From protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Mercier, F., Hatton, G. I. Connexin 26 and basic fibroblast growth factor are expressed primarily in the subpial and subependymal layers in adult brain parenchyma: Roles in stem cell proliferation and morphological plasticity. J Comp Neurol. 431 (1), 88-104 (2001).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (1), 141-145 (1988).
- Nordqvist, A. C., Mathiesen, T. Expression of IGF-II, IGFBP-2, -5, and -6 in meningiomas with different brain invasiveness. J Neurooncol. 5, 19-26 (2002).
- Zumkeller, W., Westphal, M. The IGF/IGFBP system in CNS malignancy. Mol Pathol. 54 (4), 227-229 (2001).
- Wang, L., et al. Promise and limits of the CellSearch platform for evaluating pharmacodynamics in circulating tumor cells. Semin Oncol. 43 (4), 464-475 (2016).
- Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 8, 160 (2023).
- Chen, J., et al. The development and improvement of immunodeficient mice and humanized immune system mouse models. Front Immunol. 13, 1007579 (2022).
- Law, V., et al. A Murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033 (2021).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
- Luo, Y. T., et al. The viable circulating tumor cells with cancer stem cells feature, where is the way out. J Exp Clin Cancer Res. 37, 38 (2018).
- Stumm, R., Kolodziej, A., Schulz, S., Kohtz, J. D., Hollt, V. Patterns of SDF-1alpha and SDF-1gamma mRNAs, migration pathways, and phenotypes of CXCR4-expressing neurons in the developing rat telencephalon. J Comp Neurol. 502 (3), 382-399 (2007).
- Aviezer, D., et al. basal lamina proteoglycan, promotes basic fibroblast growth factor-receptor binding, mitogenesis, and angiogenesis. Cell. 79 (6), 1005-1013 (1994).
- Tiwary, S., et al. ERBB3 is required for metastasis formation of melanoma cells. Oncogenesis. 3 (7), e110 (2014).
- Sun, X., et al. miR-7 reverses the resistance to BRAFi in melanoma by targeting EGFR/IGF-1R/CRAF and inhibiting the MAPK and PI3K/AKT signaling pathways. Oncotarget. 7 (33), 53558-53570 (2016).
- Satyamoorthy, K., Li, G., Vaidya, B., Patel, D., Herlyn, M. Insulin-like growth factor-1 induces survival and growth of biologically early melanoma cells through both the mitogen-activated protein kinase and beta-catenin pathways. Cancer Res. 61 (19), 7318-7324 (2001).
- Lin, N. U., et al. Tucatinib vs Placebo, both in combination with Trastuzumab and Capecitabine, for previously treated ERBB2 (HER2)-positive metastatic breast cancer in patients with brain metastases: Updated exploratory analysis of the HER2CLIMB randomized clinical trial. JAMA Oncol. 9 (2), 197-205 (2023).
- Russo, A., et al. Ceritinib-induced regression of an insulin-like growth factor-driven neuroepithelial brain tumor. Int J Mol Sci. 20 (17), 4267 (2019).
- Ohsie, S. J., Sarantopoulos, G. P., Cochran, A. J., Binder, S. W. Immunohistochemical characteristics of melanoma. J Cutan Pathol. 35 (5), 433-444 (2008).
- Kulasinghe, A., et al. Short term ex-vivo expansion of circulating head and neck tumour cells. Oncotarget. 7 (37), 60101-60109 (2016).
- Li, X., et al. Clinical significance of detecting CSF-derived tumor cells in breast cancer patients with leptomeningeal metastasis. Oncotarget. 9 (2), 2705-2714 (2018).
- Lelliott, E. J., et al. A novel immunogenic mouse model of melanoma for the preclinical assessment of combination targeted and immune-based therapy. Sci Rep. 9 (1), 1225 (2019).
.