JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Ex Vivo Kweek van circulerende tumorcellen in het cerebrale ruggenmergvocht van melanoompatiënten om melanoom-geassocieerde leptomeningeale ziekte te bestuderen

Published: March 29, 2024
doi:
10.3791/66071
, , , , ,
1Department of Tumor Biology,University of South Florida, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, 2Department of Neuro-Oncology,University of South Florida, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, 3Department of Cancer Physiology,University of South Florida, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, 4Department of Comparative Medicine,University of South Florida, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute

Summary

Dit artikel beschrijft een protocol voor de voortplanting van cerebrale spinale wervelvocht-circulerende tumorcellen (CSF-CTC’s) verzameld van patiënten met melanoom-geassocieerde leptomeningeale ziekte (M-LMD) om preklinische modellen te ontwikkelen om M-LMD te bestuderen.

Abstract

Melanoom-geassocieerde leptomeningeale ziekte (M-LMD) treedt op wanneer circulerende tumorcellen (CTC’s) het cerebrale ruggenmergvocht (CSF) binnendringen en de hersenvliezen, de membraanlagen die de hersenen en het ruggenmerg beschermen, koloniseren. Eenmaal vastgesteld, is de prognose voor M-LMD-patiënten somber, met een totale overleving variërend van weken tot maanden. Dit is voornamelijk te wijten aan een gebrek aan ons begrip van de ziekte en, als gevolg daarvan, de beschikbaarheid van effectieve behandelingsopties. Het definiëren van de onderliggende biologie van M-LMD zal het vermogen om beschikbare therapieën voor de behandeling van M-LMD aan te passen aanzienlijk verbeteren of nieuwe remmers te ontwerpen voor deze universeel dodelijke ziekte. Een belangrijke barrière ligt echter in het verkrijgen van voldoende hoeveelheden CTC’s uit de van de patiënt afgeleide CSF (CSF-CTC’s) om preklinische experimenten uit te voeren, zoals moleculaire karakterisering, functionele analyse en in vivo werkzaamheidsstudies. Het ex vivo kweken van CSF-CTC’s is ook een uitdaging gebleken. Om dit aan te pakken, wordt een nieuw protocol ontwikkeld voor de kweek van patiënt-afgeleide M-LMD CSF-CTC’s ex vivo en in vivo . De opname van geconditioneerde media geproduceerd door menselijke meningeale cellen (HMC’s) blijkt van cruciaal belang te zijn voor de procedure. Cytokine-array-analyse onthult dat factoren geproduceerd door HMC’s, zoals insuline-achtige groeifactorbindende eiwitten (IGFBP’s) en vasculaire endotheliale groeifactor-A (VEGF-A), belangrijk zijn bij het ondersteunen van CSF-CTC-overleving ex vivo. Hier wordt het nut van de geïsoleerde, van de patiënt afgeleide CSF-CTC-lijnen aangetoond bij het bepalen van de werkzaamheid van remmers die zich richten op de insuline-achtige groeifactor (IGF) en mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) signaleringsroutes. Bovendien wordt het vermogen aangetoond om deze cellen in vivo intrathecaal te inoculeren om muizenmodellen van M-LMD op te stellen die kunnen worden gebruikt voor preklinische tests van goedgekeurde of nieuwe therapieën. Deze hulpmiddelen kunnen helpen bij het ontrafelen van de onderliggende biologie die de vestiging van CSF-CTC in de hersenvliezen stimuleert en nieuwe therapieën identificeren om de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met M-LMD te verminderen.

Introduction

Leptomeningeale ziekte (LMD) treedt op wanneer circulerende tumorcellen (CTC’s) zich verspreiden in het cerebrale ruggenmergvocht (CSF) en zich vestigen in de hersenvliezen, het membraan rond de hersenen en het ruggenmerg 1,2. LMD kan bij verschillende vormen van kanker voorkomen, maar komt vooral voor bij melanoom. In gevorderde stadia van melanoom zal ongeveer 5% van de patiënten melanoom-geassocieerde M-LMD 2,3 ontwikkelen. Hoewel relatief laag met betrekking tot andere plaatsen van metastase, zijn de gevolgen van M-LMD verwoestend, met een totale overleving variërend van weken tot maanden, en levert het een belangrijke bijdrage aan de morbiditeit van de patiënt 1,3,4. Dit is voornamelijk te wijten aan een gebrek aan effectieve behandelingsopties in combinatie met grote hiaten in onze kennis over hoe de leptomeningen worden gekoloniseerd door melanoomcellen2. Daarom zal het begrijpen van de biologie van M-LMD het gemakkelijker maken om nieuwe therapieën te ontwerpen om de klinische resultaten te verbeteren.

Recente rapporten hebben aangetoond hoe CTC’s de unieke CSF-micro-omgeving koloniseren. Complement C3 bevordert bijvoorbeeld de invasie van tumorcellen in de CSF via de plexus choroideus, een ingewikkeld netwerk van bloedvaten in elk ventrikel van de hersenen. Verder kunnen CTC’s, als reactie op de schaarse micronutriënten in de CSF, lipocaline-2, een ijzerwegvangend eiwit, en zijn receptor SLC22A17 om de overleving te verbeteren6. Met behulp van omic-gebaseerde analyses van CSF, ontdekte onze groep ook dat de CSF is verrijkt met eiwitten die insuline-achtige groeifactor (IGF) -signalering reguleren, evenals aangeboren immuniteit3. Samen benadrukken deze gegevens de waarde van CSF-CTC’s uit vloeibare biopsieën om M-LMD te bestuderen.

Hoewel CSF-CTC’s soms kunnen worden geïdentificeerd door CSF van patiënten te bemonsteren via lumbaalpunctie, Ommaya-reservoir of snelle autopsies, is een belangrijke beperking het verkrijgen van voldoende aantallen van deze zeldzame en fragiele cellen 1,7. Met behulp van de CTC-opsommingstechniek zijn bijvoorbeeld slechts enkele honderden tot enkele duizenden tumorcellen per patiënt identificeerbaar CSF-monster7, wat het moeilijk maakt om moleculaire en functionele analyses in vitro of in vivo uit te voeren. Hoewel er meldingen zijn geweest van succes bij het kortstondig kweken van CTC’s ex vivo uit perifeer bloed (d.w.z. CTC’s van borstkanker)8,9,10, groeien deze cellen meestal alleen voor de korte termijn en zijn er geen gevallen gemeld van het kunnen laten groeien van melanoom-CTC’s in de CSF. Daarom zal het vinden van manieren om melanoom CSF-CTC’s, of CTC’s in het algemeen, te propageren, zeer nuttig zijn om de biologie van M-LMD 7,11 te bestuderen.

Voor het eerst wordt een nieuwe techniek beschreven om CSF-CTC’s van M-LMD-patiënten ex vivo te vermeerderen. Hier in dit rapport is een gedetailleerd protocol ontwikkeld dat de kweek en uitbreiding van CSF-CTC’s van M-LMD-patiënten mogelijk maakt. Aangezien de hersenvliezen een verscheidenheid aan groeifactoren afscheiden, zoals FGF, IGF, VEGF-A en IGFBP’s die de groei rond hun omgeving ondersteunen 12,13,14,15,16, werd gerationaliseerd dat CSF-CTC’s mogelijk vereisen dat deze componenten groeien in ex vivo-omstandigheden. Daarom maakt dit protocol gebruik van geconditioneerde media die worden gegenereerd door het kweken van menselijke meningeale cellen (HMC’s) in vitro. Voor in vivo inoculatie worden van de patiënt afgeleide cellen geïnoculeerd in immunodeficiënte muizen om van de patiënt afgeleide CSF-CTC’s (PD-CSF-CTC’s) lijnen te genereren. De beschikbaarheid van van de patiënt afgeleide M-LMD-cellen zal cellulaire, moleculaire en functionele tests ondersteunen om M-LMD te bestuderen en nieuwe behandelingsstrategieën voor deze dodelijke ziekte voor te stellen.

Protocol

De verzameling van geanonimiseerde CSF-monsters van patiënten werd goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van de University of South Florida (MCC 50103, 50172 en 19332). Patiënten met M-LMD kunnen op verschillende manieren worden gediagnosticeerd, waaronder positieve CSF-cytologie, een karakteristieke magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) van de hersenen en/of wervelkolom, of een combinatie van klinische bevindingen met suggestieve MRI-bevindingen. CSF van deze M-LMD-patiënten werd routinematig verzameld als onderdeel van hun standaard klinische zorg. Er wordt geen procedure uitgevoerd tenzij er een klinische indicatie is. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten voor het verzamelen van monsters en het gebruik ervan voor onderzoek en publicatie. Het genereren van in vivo muizen-LMD-modellen werd goedgekeurd door het University of South Florida Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC# IS00010398). Het algemene schema van dit protocol is samengevat in figuur 1. De details van de reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. 1. Bereiding van HMC-geconditioneerde media Smeer een T175-kolf voor met poly-l-lysine bij 2 μg/cm2. Zet de kolf gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C. Zuig de poly-l-lysineoplossing op met behulp van een steriele serologische pipet. Het is niet nodig om de kolf te spoelen en is klaar voor de HMC-cultuur. Kweek ongeveer 1,0 x 106 HMC’s in 30 ml compleet Meningeal Culture Medium (MenCM), dat 5% foetaal runderserum, 1% meningeale celgroeisupplement en 100 I.E./ml penicilline-streptomycine antibiotische oplossing per kolf bevat. Kweek de cellen in de celkweekincubator bij standaard weefselkweekomstandigheden bij 37 °C en 5% CO2 . Wissel elke 3 dagen van medium. Wanneer cellen ongeveer 75%-80% confluentie bereiken, verzamelt en bewaart u de HMC-gekweekte media in een kegelvormige buis van 50 ml. Splits HMC’s op in nieuwe T175-kolven en verse, complete MenCM als er meer HMC-gekweekte media nodig zijn. Voeg aan de HMC gekweekte media een 1:1 verhouding van complete MenCM toe. Voeg 20 ng/ml fibroblastgroeifactor (FGF) en 20 ng/ml epidermale groeifactor (EGF) toe, die de HMC-geconditioneerde media voor CSF-CTC’s worden.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om verse FGF en EGF toe te voegen wanneer CTC’s klaar zijn om te kweken. Bewaar HMC-geconditioneerde media in aliquots van 50 ml bij 4 °C.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om HMC-geconditioneerde media in aliquots te bewaren bij 4 °C, maar niet langer dan 4 weken. 2. Verzameling van CSF en monsterverwerking Centrifugeer de voorkoelmachine door deze in te stellen op 4 °C. Zodra het CSF-monster bij de patiënt is afgenomen, plaatst u het CSF-monster onmiddellijk in een conische buis van 15 ml op ijs om het koel te houden.OPMERKING: Ons door de IRB goedgekeurde protocol maakt het mogelijk om 7,5 ml CSF af te nemen van de patiënt die ermee instemt. Centrifugeer het CSF bij 257 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder, bewaar en maak aliquots van het CSF-supernatans zonder de celpellet aan de onderkant te verstoren. Bovendrijvende aliquots van KVP kunnen indien nodig ingevroren bij -80 °C worden bewaard voor verdere analyse.OPMERKING: De pellet is mogelijk niet zichtbaar voor het blote oog; daarom wordt aangeraden om ~40-50 μL op de bodem van de buis te laten. Voeg in dezelfde tube 1 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe om de cellen te resuspenderen en te spoelen, en herhaal centrifugeren op 257 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.OPMERKING: (Optioneel) Voer lysis van rode bloedcellen (RBC) uit als het monster bloedverontreiniging bevat. Houd er echter rekening mee dat sommige cellen tijdens het proces verloren kunnen gaan, waaronder CTC’s. CTC’s kunnen worden vermeerderd zonder de RBC-lysisprocedure. Verwijder PBS en gooi het weg zonder de celkorrel te verstoren en laat ~50 μL op de bodem achter. Voer celtelling uit om de levensvatbaarheid van de cel te bepalen. Vanaf hier zijn er twee opties om door te gaan met het kweken van CSF-CTC’s: in vitro kweek (stap 3) of poging tot in vivo uitbreiding van het xenotransplantaat van de patiënt (stap 4).OPMERKING: Als CSF-CTC’s op een later tijdstip moeten worden gekweekt, cryopreservatie de cellen in celcultuurvriesmedia totdat ze klaar zijn voor vermeerdering. Bevriezingsmedia voor celcultuur kunnen worden gemaakt met 90% FBS + 10% DMSO. Als er een teveel aan CSF beschikbaar is (d.w.z. er wordt meer dan één CSF-verzameling van patiënten verzameld of CSF wordt verzameld bij autopsie), kunnen CTC’s worden geëvalueerd door het monster in te dienen voor CTC-tellingstest17 of immunofluorescentie (IF) kleuring voor melanoommarker (d.w.z. anti-MLANA) die inzicht kan geven in de hoeveelheid en levensvatbaarheid van CTC’s. Cellen kunnen niet worden hersteld na het uitvoeren van deze experimenten. Daarom wordt het niet aanbevolen als er geen back-up CSF-monsters van de patiënt zijn. 3. In-vitrocultuur en uitbreiding van CSF-CTC’s Resuspendeer CSF-CTC’s in HMC-geconditioneerde media. Als CSF-CTC’s zijn gecryopreserveerd, ontdooi dan de cellen, draai ze en was ze voorzichtig met PBS. Splits alle cellen in drievoud in een plaat met 96 putjes met een volume van 150 μl per putje. Alleen levensvatbare cellen zullen zich ‘s nachts licht aan het oppervlak hechten.OPMERKING: Het aantal CSF-CTC’s kan sterk variëren per steekproef van één patiënt (tabel 1). Voor patiënten met een laag aantal CTC’s wordt een plaat met 96 putjes gebruikt als uitgangspunt voor de kweek en wordt de hele pellet zonder te tellen geplateerd uit angst om CTC’s te verliezen. Als er echter een grotere hoeveelheid CSF is (d.w.z. verkregen uit een autopsie), is het mogelijk om de cellen te tellen. Niet alle tumorcellen kunnen ex vivo groeien; Sommige zullen langzaam uitzetten voor meerdere passages voordat ze statisch worden. Momenteel is de kans op succes van het ex vivo kweken van melanoom CSF-CTC’s ongeveer 60%7. Vul elke 3 dagen bij door verse HMC-geconditioneerde media toe te voegen of verwijder de media voorzichtig door de pipetpunt op de zijkant van de put te plaatsen, waarbij u wat vloeistof achterlaat zonder de bodem van de put te verstoren, en vervang deze vervolgens door verse HMC-geconditioneerde media. Wanneer ex vivo CSF-CTC’s uitzetten en voor 90% samenvloeiend worden, trypsiniseer en breng het hele putje over naar een nieuw putje in een plaat met 24 putjes. Wanneer het putje in een putje met 24 putjes samenvloeit, breng het dan over naar een plaat met 12 putjes, dan naar een plaat met 6 putjes, enzovoort.OPMERKING: Overweeg na trypsinisatie om een kleine subset van CTC’s in celcultuurvriesmedia (10% DMSO + 90% FBS) te cryoconserveren voordat u ze als back-up plateert. Ga door met het kweken van CTC’s. Sommige cellen kunnen zich op korte termijn voortplanten en uiteindelijk statisch worden. Een of meer klonen kunnen echter exponentieel transformeren en uitbreiden (Figuur 2A). Selecteer deze klonen, die de in vitro patiënt-afgeleide CSF-CTC (PD-CSF-CTC’s) culturen zullen worden.OPMERKING: Als deze klonen overvol raken of clusteren, probeer de cellen dan te puseren en opnieuw te plaatsen in een verse weefselkweekplaat/kolf. 4. In vivo inoculatie van CSF-CTC’s om cellijn-afgeleid xenotransplantaat (CDX) of patiënt-afgeleid xenotransplantaat (PDX) model te genereren OPMERKING: Een PDX-model omvat de implantatie van kankercellen rechtstreeks van een kankerpatiënt (zonder ex vivo-cultuur ), terwijl het CDX-model kankercellijnen of, in dit geval, CTC’s gebruikt die zijn gepropageerd en vereeuwigd18. Gebruik 6-8 weken vrouwelijke immunodeficiënte NOD SCID gamma (NSG) muizen voor CSF-CTC’s inoculatie. NSG’s worden gebruikt omdat ze ernstig immunodeficiënt zijn en zeer ontvankelijk zijn voor implantatie van menselijke tumorcellen19. Vanwege hun immuundeficiënties moeten deze muizen in een strikt gecontroleerde hygiënische omgeving worden gehouden en geïsoleerd van andere muizenstammen worden gehuisvest. De methode om muizen-LMD weer te geven is elders in detail beschreven20.OPMERKING: ex vivo-cellen (CSF-CTC’s van patiënten die pas in stap 2 zijn verwerkt zonder te kweken) worden gebruikt om het PDX-model te genereren; fysieke observatie van het dier en MRI van de hersenen zijn nodig om LMD-progressie te bepalen. Aan de andere kant, met het CDX-model dat in vitro wordt gebruikt, kunnen PD-CSF-CTC’s worden gelabeld met een luciferase-reporter en kan de status van LMD worden beoordeeld door bioluminescente beeldvorming (BLI). Het cellabelsysteem dat in dit rapport wordt gebruikt, is een NanoLuc (NL)-verslaggever die furimazine als substraat gebruikt, waarvan is aangetoond dat het de gevoeligheid verhoogt in verhouding tot tumorgroei21. Een interferentie van de groei van CTC-cellen (in vitro of in vivo) door NL-expressie werd niet waargenomen. Controleer op tekenen van LMD-progressie met behulp van deze methoden: fysieke observatie: gewichtsverlies, kanteling van het hoofd en gebogen rug. MRI: vergrote ventrikels en tekenen van hydrocefalie (Figuur 2B). BLI: positieve bioluminescente signalen in het CZS-gebied (Figuur 2C). 5. CSF-verzameling van muizen met LMD voor daaropvolgende kloonuitbreiding Verdoof de NSG-muis met LMD met 4% isofluraan (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) totdat deze geen tekenen van de oprichtreflex meer vertoont. Bereid de muis voor door de vacht van het gehele ventrale oppervlak van het hoofd te scheren en bereid de huid voor met een steriele techniek. Plaats de neus met behulp van een aangepaste L-vormige neuskegel van het stereotactische apparaat en zorg ervoor dat de neusgaten vrij blijven. Zet de huid vast door deze voorzichtig met tape over de ventrale oppervlakken van beide oorschelpen naar voren te trekken, deze aan de neuskegel te bevestigen en vervolgens de nek in een hoek van ongeveer 90° te buigen nadat deze is vastgezet. Dien 1,5%-3% isofluraan toe om de anesthesie te behouden. Strek de nek volledig uit en begin net tussen de oorschelpen, leid de chirurgische schaarpunten met lichte druk naar beneden over het achterhoofdsbeen.OPMERKING: In deze middellijnpositie is een subtiele depressie waarneembaar als de schaarpunten het holle gebied boven de cisterna magna binnenkomen. Maak een kleine incisie in de middellijn van 5-7 mm net boven de palpatieholte. Gebruik een tang met stompe punt en punten van 1-2 mm om voorzichtig druk uit te oefenen op de cisterna magna. Breng de tips in een gesloten positie aan en open ze terwijl u neerwaartse druk uitoefent op de dura. Herhaal het stompe dissectieproces zoals beschreven in stap 6 totdat het durale membraan duidelijk waarneembaar is en de bijbehorende bloedvaten zichtbaar zijn in het blootgestelde gebied. Terwijl u de tang open houdt om de omringende spieren in te trekken, steekt u een naald van 27-29 G die is bevestigd aan een spuit van 1 ml onder de dura om de afschuining te visualiseren. Zorg ervoor dat de naald net voorbij de afschuining doordringt. Trek de zuiger van de spuit geleidelijk terug. Verzamel zoveel mogelijk CSF (meestal tussen 15-30 μL) voorafgaand aan euthanasie met muizen.OPMERKING: Euthanasie wordt, volgens institutioneel goedgekeurde protocollen, bereikt door de proefpersoon bloot te stellen aan escalerende concentraties gecomprimeerd CO2 -gas. Een verplaatsingssnelheid van 30% tot 70% van het kamervolume per minuut zal bijvoorbeeld worden gebruikt om ongemak of angst te voorkomen of te verminderen. Dit wordt gevolgd door het stoppen van cardiovasculaire en ademhalingsbewegingen door langdurige observatie in de kamerlucht gedurende langer dan 10 minuten. Plaats de CSF van de spuit in een microcentrifugebuis en plaats deze op ijs. Draai het monster gedurende 5 minuten bij 4 °C op 257 x g en verwijder de vloeistof voorzichtig (vries het CSF-monster van de muis in bij -80 °C indien nodig voor verdere analyse) zonder de celpellet te verstoren. Voeg 500 μL steriele PBS toe en was de celkorrel; Herhaal centrifugeren op 257 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer cellen in HMC-geconditioneerde media in een plaat met 96 putjes.OPMERKING: CSF-CTC’s die in vivo zijn geënt en met succes tot LMD zijn gekweekt, moeten kunnen groeien als normale celculturen. Blijf uitbreiden door elke 3 dagen van media te wisselen. Trypsiniseer cellen en breng ze over naar een groter celkweekapparaat wanneer de cellen samenvloeien. Deze cellen zullen de in vivo PD-CSF-CTC-culturen worden. In het huidige rapport was er een slagingspercentage van 100% met het CDX-model en moeten er nog geen PDX M-LMD worden gegenereerd.

Representative Results

Het begrijpen van de vereisten voor een succesvolle groei van CSF-CTC’s ex vivo is een voortdurende inspanning. Daartoe wordt aangenomen dat het van cruciaal belang is om essentiële factoren aan te reiken die de micro-omgeving van het CB nabootsen22. Menselijke meningeale cellen (HMC’s) scheiden een verscheidenheid aan groeifactoren af in de CSF, waaronder FGF-2, EGF, IGFBP2 en IGFBP6, en het is bekend dat ze de groei van CTC-cellen ondersteunen 12,13,14,23,24. Daarom werd een menselijke cytokine-array-analyse uitgevoerd op HMC-geconditioneerde media om potentieel belangrijke componenten te identificeren die nodig zijn voor CTC-overleving. Inderdaad, verschillende groeifactoren werden geüpreguleerd in de media die met HMC’s werden gekweekt (Figuur 3A). Bijvoorbeeld granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF), VEGF-A en IGFBP’s (IGFBP2, 3, 4 en 6). De CSF-cellulaire componenten van patiënten kunnen bestaan uit meerdere celtypen, zoals CTC’s, immuuncellen en fibroblasten. Niet-CTC’s zullen uiteindelijk stoppen met het maken van overuren. Over het algemeen zijn cellen die zich met succes voortplanten en in proliferatie blijven, kankercellen (M-LMD). Validatie van groeiende cellen in cultuur is inderdaad M-LMD-cellen, wat kan worden gedaan door IF-detectie van MLANA-expressie en transcriptomische analyses, die eerder zijn aangetoond7. Als een proof of concept om het potentiële gebruik en de toepassing van gevestigde in vitro en in vivo PD-CSF-CTC-lijnen aan te tonen, werd single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) analyse gebruikt, en de resultaten onthulden verschillende genen die waren verrijkt en behouden van de niet-gekweekte patiënt CSF-CTC’s7. Twee daarvan omvatten receptortyrosine-eiwitkinase ErbB3 en IGF-1R, die implicaties hebben voor de progressie van melanoom en resistentie tegen chemotherapie 25,26,27. Om te testen of ze een rol speelden bij de overleving van CSF-CTC, werd een kristalviolette proliferatietest uitgevoerd op PD-CSF-CTC’s die werden behandeld met door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen tucatinib en ceritinib die zich respectievelijk richten op ErbB28 en IGF-1R 7,29. Anti-IGFBP2-antilichaam werd opgenomen als een positieve controle die de groei van PD-CSF-CTC-culturen zou moeten belemmeren. De resultaten toonden aan dat de afwezigheid van IGFBP2 of IGF-1R effectief was in het verminderen van de proliferatie van PD-CSF-CTC’s (Figuur 3B). Aangezien MAPK-signalering stroomafwaarts van IGF-1R plaatsvindt, werden calceïne-AM levende celkleuring en MTT-celoverlevingstesten ook uitgevoerd in drie M-LMD PD-CSF-CTC-lijnen door ze te behandelen met ceritinib of de MAPK-remmers, dabrafenib en trametinib of een combinatie van alle drie. De gegevens toonden aan dat de levensvatbaarheid van alle drie de cellijnen significant werd verminderd door ceritinib, terwijl dabrafenib en trametinib gemengde effecten hadden (figuur 3C). Het resultaat van behandelingen met debrafenib en trametinib was verrassend. Alle drie de PD-CSF-CTC-lijnen zijn afgeleid van M-LMD-patiënten die een BRAFV600E-mutatie hadden 7. Dit kan wijzen op een verworven chemoresistentie-effect van CSF-CTC’s, iets dat in de toekomst moet worden onderzocht. Vervolgens, als voorbeeld van hoe PD-CSF-CTC’s in vivo kunnen worden gebruikt, werden muizen-M-LMD-modellen ontwikkeld door intrathecaal geïnoculeerd met verschillende aantallen PD-CSF-CTC’s. De mediane overlevingstijden bij muizen werden bepaald (Figuur 3D). Om de progressie van M-LMD te visualiseren, werden PD-CSF-CTC-lijnen getagd met een bioluminescente marker, zoals het NL-reportersysteem21, en vastgelegd door BLI (Figuur 2C). De locatie van de LMD-metastasen werd ook aangetoond met behulp van immunohistochemie met eiwit melan-A (MLANA)30 als marker van de melanoomcellen (Figuur 3E). Als proof of concept om therapeutische strategieën tegen M-LMD in vivo te testen, kregen muizen-M-LMD-cohorten dagelijks orale monotherapie van ceritinib of trametinib, of een combinatie van dabrafenib en trametinib of ceritinib en trametinib. Het (onbehandelde) controlecohort kreeg ter vergelijking orale zoutoplossing. De resultaten toonden een significant verlengde overleving (Figuur 3F) en vertraagde ziektedetectie (Figuur 3G) in het cohort dat werd behandeld met ceritinib en trametinib (onbehandelde M-LMD mediane overleving: 28,5 dagen vs. met ceritinib en trametinib behandelde M-LMD mediane overleving: 38,5 dagen; P-waarde = 0,0052). Deze gegevens onderstrepen het potentiële nut van de ontwikkelde M-LMD PD-CSF-CTC-lijnen voor het uitvoeren van preklinische studies om de werkzaamheid van nieuwe therapieën te bepalen. Figuur 1: Een schematisch overzicht van het proces van het vormen van patiënt-afgeleide CSF-circulerende tumorcellen (PD-CSF-CTC’s). CSF van patiënten kan worden bemonsterd via lumbaalpunctie, Ommaya-reservoir of snelle autopsies. Door middel van een reeks in vitro en in vivo propagaties genereert elke stap een intermediaire CSF-CTC-cultuur (d.w.z. CSF-CTC’s van de patiënt, in vitrocultuur , in vivo cultuur) totdat een PD-CSF-CTC-lijn tot stand wordt gebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Voorbeelden van in vitro en in vivo kweek van CSF-CTC’s afkomstig van M-LMD-patiënten. (A) Representatieve helderveldbeelden die de in vitro groei van een M-LMD CSF-CTC-kolonie tonen na 6 weken en 9 weken in HMC-geconditioneerde media. Schaalbalk: 1000 μm. (B) MRI-beelden 4 weken en 8 weken na intrathecaal geïnoculeerd met PD-CSF-CTC’s; een succesvolle oprichting van een muizenmodel van M-LMD. Gele pijlen wijzen op vergrote ventrikels en mogelijke hydrocefalie bij deze M-LMD muis. (C) Representatieve BLI-visualisatie van de ontwikkeling van M-LMD bij muizen. De figuur is een bewerking van Law et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: PD-CSF-CTC-lijnen worden gebruikt in verschillende preklinische experimenten om M-LMD te bestuderen. (A) Een menselijke cytokine-array die een toename toont van verschillende uitgescheiden groeifactoren (d.w.z. IGFBP’s, VEGF-A en GM-CSF) in kweekmedia (MenCM) in aanwezigheid van menselijke meningeale cellen (HMC’s). (B) Een gescand beeld van een proliferatietest van kristalviolette cellen om de werkzaamheid van anti-IGFBP2-antilichaam, tucatinib en ceritinib tegen een van de PD-CSF-CTC-lijnen te bepalen. De controleconditie kreeg een voertuigbehandeling. Het experiment werd uitgevoerd in drievoud. (C) Celoverlevingstest van drie verschillende gevestigde PD-CSF-CTC-lijnen (van patiënten 09, 12 en 16) in vitro. Cellen werden behandeld met ceritinib (cer), een combinatie van dabrafenib (dab) + trametinib (tra), cer + tra, of alle drie. De cellen werden 72 uur na de behandeling verzameld. Calceïne-AM-kleuring werd gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te visualiseren en een MTT-test werd gebruikt om de overleving van de cel te bepalen. Een gepaarde steekproef t-toets werd gebruikt voor statistische analyse. Schaalbalken: 20 μm. (D) Een overlevingscurve van een muizen M-LMD-model. NSG-muizen werden intrathecaal (via de cisterna magna) geïnoculeerd met een van de PD-CSF-CTC-lijnen op 10.000, 20.000 en 50.000 cellen. De mediane overleving van M-LMD-muizen werd bepaald. (E) IHC-detectie voor MLANA, een marker voor melanoom, in de hersensecties van M-LMD-muizen. Positief MLANA werd gevonden in de hersenvliezen (rood gekleurd; aangegeven door gele pijlen), terwijl de normale (gezonde) hersenen geen kankergroei vertoonden (negatief voor MLANA). Schaalbalken: 200 μm. (F) Een representatief werkzaamheidsexperiment van muizen M-LMD-cohorten die dagelijks orale zoutoplossing, cer, tra, dab/tra of cer/tra krijgen. De overleving van muizen werd bepaald. De log-rank (Mantel-Cox) test werd gebruikt voor statistische analyse. (G) Representatieve BLI-beelden van M-LMD-progressie in 5 weken, waarbij de behandelde controle (zoutoplossing) wordt vergeleken met. cer/tra behandelde muizen M-LMD-cohorten. Paneel (C) van de figuur is een bewerking van Law et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Samenvatting van klinische CSF-CTC’s verkregen voor ex vivo kweek bij M-LMD-patiënten. Een overzichtstabel van 11 M-LMD-patiënten, waarvan is geprobeerd hun CSF-CTC’s te propageren. De patiënten in de Tabel werden eerder gekarakteriseerd in Law et al.7. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

M-LMD is een verwoestende, universeel dodelijke ziekte en er is dringend behoefte aan betere behandelingsstrategieën. Een van de belangrijkste belemmeringen voor het bestuderen van M-LMD is het onvermogen om voldoende CSF-CTC’s te verwerven om moleculaire en functionele studies uit te voeren 1,7. Hoewel er bestaande methoden zijn om CTC’s te kweken uit perifeer bloed en CSF van andere soorten kanker, zoals borst- en eierstokkanker 11,31,32, zijn deze CTC-propagatiemethoden meestal van korte duur en is er geen succes gemeld bij het kweken van CSF-CTC’s uit melanoom. Bovendien bestaan de huidige methodologieën voor het propageren van CTC’s in ex-vivo-omgevingen op korte termijn en moeten ze nog een in vivo LMD-model opleveren dat is afgeleid van LMD-cellen van patiënten. Hier wordt een nieuw protocol gepresenteerd om deze cellen in vitro en in vivo te kweken, wat leidt tot unieke, van de patiënt afgeleide cellijnen. Momenteel was er van de 11 M-LMD-patiënten in de studie een kans van ongeveer 60% (7 van de 11) op succes bij het propageren van M-LMD CSF-CTC’s in vitro, en hoewel dit werd verlaagd tot ~20% (2 van 11) in vivo met behulp van de CDX-methode7.

Het is duidelijk dat in vitro omstandigheden de micro-omgeving van het CSF niet samenvatten. Er zijn echter eerder proteomische benaderingen uitgevoerd om eiwitcomponenten in de CSF te bestuderen en hebben enkele inzichten opgeleverd over de belangrijkste factoren die nodig waren voor CTC-groei ex vivo3. Er werd bijvoorbeeld vastgesteld dat een van de belangrijkste routes die CTC-overleving bij M-LMD-patiënten bevordert, geassocieerd was met verhoogde IGF-gerelateerde activiteiten 3,7. Verder hebben studies aangetoond dat de leptomeninges een verscheidenheid aan cytokines/groeifactoren afscheiden in de CSF, waaronder FGF-2, EGF, GM-CSF en eiwitten die verband houden met IGF-signalering12. Dit werd inderdaad gerecapituleerd in de media die met HMC’s werden gecultiveerd, wat een mogelijke rol van deze groeifactoren bij het bevorderen van de groei van CSF-CTC ondersteunde.

Een groot voordeel bij het genereren van een PDX-model (of CDX) is de mogelijkheid om diepere inzichten te krijgen in de pathologie van ziekten, iets wat in vitro-omstandigheden ontbreekt. Idealiter wordt de voorkeur gegeven aan een PDX-benadering, aangezien de CSF-CTC’s rechtstreeks afkomstig zijn van patiënten zonder ex vivo kweek. Aanvankelijk werden pogingen ondernomen om M-LMD te creëren met behulp van deze aanpak, maar deze zijn tot nu toe niet succesvol geweest. De moeilijkheid om PDX-muizen te genereren houdt mogelijk verband met de overvloed en integriteit van het uitgangsmateriaal (d.w.z. zeer weinig levensvatbare CTC’s in CSF van de patiënt bij routinematige verzameling in de kliniek). Dit kan verklaren waarom we superieur succes hadden met het kweken van CTC’s van CSF verzameld bij autopsie7. Om de kans op in vivo voortplanting te vergroten, werd dit protocol aangepast om een alternatieve CDX-benadering te bieden. CSF-CTC’s kunnen eerst in vitro (stap 3) worden uitgebreid om PD-CSF-CTC-lijnen te genereren die op lange termijn een groter groeipotentieel hebben. Deze cellen worden vervolgens geënt bij muizen om M-LMD te creëren. Hoewel de huidige methode een beperkt aantal in vivo CDX M-LMD-modellen (~ 20%) modellen genereerde, zou dit een weerspiegeling kunnen zijn van de transcriptionele diversiteit van CSF-CTC’s, de complexiteit van de CSF-micro-omgeving en de moeilijkheid om deze cellen in het algemeen te kweken. We stellen dat de toekomstige ontwikkeling van een gehumaniseerd muismodel het slagingspercentage van de implantatie kan verbeteren, gezien het belang van de micro-omgeving bij het ondersteunen van de levensvatbaarheid vankankercellen33.

Een beperking van de CDX-benadering is dat alleen bepaalde klonen werden geselecteerd uit patiëntenmonsters, en dat genetische drift van kankercellen door middel van ex vivo kweek mogelijk niet langer het transcriptionele profiel van de oorspronkelijke bron weerspiegelt. Er is echter gemeld dat ondanks in vitro kweek, PD-CSF-CTC-lijnen ongeveer 97% gelijkenis van genexpressie behielden met geïsoleerde, niet-gekweekte CSF-CTC’s van patiënten7. In die studie onthulden scRNA-seq-analyses overlappende verrijkte genhandtekeningen tussen niet-gekweekte, in vitro PD-CSF-CTC’s en in vivo PD-CSF-CTC’s, zoals SOX9, ErbB3 en IGF-1R7, wat suggereert dat dit potentiële therapeutische doelen kunnen zijn. Bovendien zijn deze vaak verrijkte genen betrokken bij biologische routes die verband houden met transcriptionele regulatie en metabolisme7. Gezamenlijk benadrukt dit de translationele waarde van PD-CSF-CTC-culturen voor een beter begrip van de biologie van M-LMD, het identificeren van doelgerichte moleculaire mechanismen en routes die de ziekte aandrijven, en het ontwerpen van rationele therapieën in toekomstige studies.

Hoewel de huidige methodologie onvolmaakt blijft, omdat er geen manier is om de status en levensvatbaarheid van CSF-CTC’s bij M-LMD-patiënten vooraf te bepalen, zijn er verschillende observaties gedaan die de kans op succes zouden vergroten, aangezien de CTC’s laag in aantal en vrij kwetsbaar zijn. Deze kritieke stappen omvatten coördinatie met de kliniek om CSF-monsters op ijs te laten plaatsen zodra ze zijn getrokken en ze snel naar het laboratorium te laten vervoeren om de cellulaire integriteit te behouden. Vervolgens moeten CSF-CTC’s onmiddellijk worden verwerkt, hetzij door ze in cultuur te brengen, hetzij door de cellen te cryoconserveren.

Over het algemeen was het kweken en uitbreiden van CSF-CTC’s een proces van vallen en opstaan, maar de oprichting van dit protocol om van de patiënt afgeleide M-LMD-cellen te genereren, zal onderzoekers de middelen geven die nodig zijn om experimenten uit te voeren met patiëntmonsters, die voorheen niet hadden kunnen worden gedaan. Een belangrijk doel voor de toekomst is het gebruik van M-LMD PD-CSF-CTC’s voor het uitvoeren van moleculaire karakterisering, screening van geneesmiddelen met hoge doorvoer en in vivo onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen om rationele therapieën te ontwerpen voor de behandeling van M-LMD. Er wordt aangenomen dat deze aanpak zal leiden tot behandelingsstrategieën die de morbiditeit en mortaliteit die gepaard gaan met dit momenteel fatale aspect van gevorderd gemetastaseerd melanoom aanzienlijk zullen verminderen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen patiënten en families bedanken voor hun buitengewone vrijgevigheid bij het doneren van weefsel voor deze wetenschappelijke studie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health-subsidies P50 CA168536, R21 CA256289, R21 CA216756 (aan KSMS en PAF) K99 CA226679 (aan IS). Moffitt Foundation Research Acceleration Fund (naar BC en PAF), Moffitt Chemical Biology & Molecular Medicine Program (PAF en DD), Moffitt Foundation (PAF). De Molecular Genomics, Tissue, and Bioinformatics & Biostatistics Shared Resource Cores bij Moffitt wordt gedeeltelijk ondersteund door het National Cancer Institute via een Cancer Center Support Grant (P30-CA076292) en de Moffitt Foundation.

Materials

1 mL syringe 27 – 29 G needles Any vendor n/a 0.1 mm Sterile Filtered
1.5 mL Eppendorf tubes Any vendor
15 ml and 50 mL polystyrene centrifuge tubes Any vendor n/a
6 -  8 weeks females NOD SCID gamma (NSG) mice Charles River Males optional
Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) Zoopharm  DEA controlled
Fetal bovine serum (FBS) ScienCell #0010
Gas inhalation anestehsia system VeteEquip #901812 COMPAC5
Hamilton microliter syringes Hamilton 10, 25, 50, and 100ml 30 G for cisterna magna injection
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) Milipore Sigma (or any vender) #F0291
Human epidermal growth factor (EGF) Milipore Sigma (or any vender) #SRP3027
Human meningeal cells (HMCs) isolated from human leptomeninges ScienCell #1400
IVIS 200 imaging system Caliper Life Sciences n/a
Magnifying glass with light Any vendor n/a
Meningeal Cell Culture Media (MenCM) ScienCell #1401
Meningeal cell growth supplement (MCGS) ScienCell #1452
MRI imaging Bruker BioSpec series Optional
P1000, P200, P20 pipettes/ pipette tips
penicillin-streptomycin Antibiotic solution ScienCell (or any vender) #0503
Phosphate buffered saline (PBS) Any vendor n/a 0.1 mm Sterile Filtered
Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) Roboz Surgical Instrument (or any vendor)
Screw cap cryo tubes 
Sterile blue paper/ drape covering Any vendor n/a n/a
Sterile cotton sticks Any vendor n/a
Tissue culture plates/flasks (96-well, 24-well, 12-well, 6-well, T175 etc.)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell Melanoma Res. 33 (4), 527-541 (2020).
  2. Khaled, M. L., Tarhini, A. A., Forsyth, P. A., Smalley, I., Pina, Y. Leptomeningeal disease (LMD) in patients with melanoma metastases. Cancers (Basel). 15 (6), 1884 (2023).
  3. Smalley, I., et al. Proteomic analysis of CSF from patients with leptomeningeal melanoma metastases identifies signatures associated with disease progression and therapeutic resistance). Clin Cancer Res. 26 (9), 2163-2175 (2020).
  4. Larkin, J., et al. Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 381, 1535-1546 (2019).
  5. Boire, A., et al. Complement component 3 adapts the cerebrospinal fluid for leptomeningeal metastasis. Cell. 168 (6), 1101-1113 (2017).
  6. Chi, Y., et al. Cancer cells deploy lipocalin-2 to collect limiting iron in leptomeningeal metastasis. Science. 369 (6501), 276-282 (2020).
  7. Law, V., et al. A preclinical model of patient-derived cerebrospinal fluid circulating tumor cells for experimental therapeutics in leptomeningeal disease from melanoma. Neuro Oncol. 24 (10), 1673-1686 (2022).
  8. Carmona-Ule, N., et al. Short-term ex vivo culture of CTCs from advance breast cancer patients: Clinical implications. Cancers (Basel). 13 (11), 2668 (2021).
  9. Zhang, L., et al. The identification and characterization of breast cancer CTCs competent for brain metastasis. Sci Transl Med. 5 (180), (2013).
  10. Yu, M., et al. Cancer therapy: Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
  11. Mohamed, B. M., et al. Ex vivo expansion of circulating tumour cells (CTCs). Sci Rep. 13 (1), 3704 (2023).
  12. Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: From protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
  13. Mercier, F., Hatton, G. I. Connexin 26 and basic fibroblast growth factor are expressed primarily in the subpial and subependymal layers in adult brain parenchyma: Roles in stem cell proliferation and morphological plasticity. J Comp Neurol. 431 (1), 88-104 (2001).
  14. Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (1), 141-145 (1988).
  15. Nordqvist, A. C., Mathiesen, T. Expression of IGF-II, IGFBP-2, -5, and -6 in meningiomas with different brain invasiveness. J Neurooncol. 5, 19-26 (2002).
  16. Zumkeller, W., Westphal, M. The IGF/IGFBP system in CNS malignancy. Mol Pathol. 54 (4), 227-229 (2001).
  17. Wang, L., et al. Promise and limits of the CellSearch platform for evaluating pharmacodynamics in circulating tumor cells. Semin Oncol. 43 (4), 464-475 (2016).
  18. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 8, 160 (2023).
  19. Chen, J., et al. The development and improvement of immunodeficient mice and humanized immune system mouse models. Front Immunol. 13, 1007579 (2022).
  20. Law, V., et al. A Murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033 (2021).
  21. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
  22. Luo, Y. T., et al. The viable circulating tumor cells with cancer stem cells feature, where is the way out. J Exp Clin Cancer Res. 37, 38 (2018).
  23. Stumm, R., Kolodziej, A., Schulz, S., Kohtz, J. D., Hollt, V. Patterns of SDF-1alpha and SDF-1gamma mRNAs, migration pathways, and phenotypes of CXCR4-expressing neurons in the developing rat telencephalon. J Comp Neurol. 502 (3), 382-399 (2007).
  24. Aviezer, D., et al. basal lamina proteoglycan, promotes basic fibroblast growth factor-receptor binding, mitogenesis, and angiogenesis. Cell. 79 (6), 1005-1013 (1994).
  25. Tiwary, S., et al. ERBB3 is required for metastasis formation of melanoma cells. Oncogenesis. 3 (7), e110 (2014).
  26. Sun, X., et al. miR-7 reverses the resistance to BRAFi in melanoma by targeting EGFR/IGF-1R/CRAF and inhibiting the MAPK and PI3K/AKT signaling pathways. Oncotarget. 7 (33), 53558-53570 (2016).
  27. Satyamoorthy, K., Li, G., Vaidya, B., Patel, D., Herlyn, M. Insulin-like growth factor-1 induces survival and growth of biologically early melanoma cells through both the mitogen-activated protein kinase and beta-catenin pathways. Cancer Res. 61 (19), 7318-7324 (2001).
  28. Lin, N. U., et al. Tucatinib vs Placebo, both in combination with Trastuzumab and Capecitabine, for previously treated ERBB2 (HER2)-positive metastatic breast cancer in patients with brain metastases: Updated exploratory analysis of the HER2CLIMB randomized clinical trial. JAMA Oncol. 9 (2), 197-205 (2023).
  29. Russo, A., et al. Ceritinib-induced regression of an insulin-like growth factor-driven neuroepithelial brain tumor. Int J Mol Sci. 20 (17), 4267 (2019).
  30. Ohsie, S. J., Sarantopoulos, G. P., Cochran, A. J., Binder, S. W. Immunohistochemical characteristics of melanoma. J Cutan Pathol. 35 (5), 433-444 (2008).
  31. Kulasinghe, A., et al. Short term ex-vivo expansion of circulating head and neck tumour cells. Oncotarget. 7 (37), 60101-60109 (2016).
  32. Li, X., et al. Clinical significance of detecting CSF-derived tumor cells in breast cancer patients with leptomeningeal metastasis. Oncotarget. 9 (2), 2705-2714 (2018).
  33. Lelliott, E. J., et al. A novel immunogenic mouse model of melanoma for the preclinical assessment of combination targeted and immune-based therapy. Sci Rep. 9 (1), 1225 (2019).

Tags

Circulating Tumor CellsCerebral Spinal FluidMelanomaLeptomeningeal DiseaseEx Vivo CultureHuman Meningeal CellsInsulin-like Growth FactorMAPK SignalingMouse Model
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Law, V., Smalley, I., Evernden, B. R., Baldwin, M., Smalley, K. S. M., Forsyth, P. A. Ex Vivo Culture of Circulating Tumor Cells in the Cerebral Spinal Fluid from Melanoma Patients to Study Melanoma-Associated Leptomeningeal Disease. J. Vis. Exp. (205), e66071, doi:10.3791/66071 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image