Ex vivo Culture de cellules tumorales circulantes dans le liquide céphalo-rachidien de patients atteints de mélanome pour étudier la maladie leptoméningée associée au mélanome

La collecte d’échantillons de LCR de patients anonymisés a été approuvée par l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de Floride du Sud (MCC 50103, 50172 et 19332). Les patients atteints de M-LMD peuvent être diagnostiqués de plusieurs façons, notamment par une cytologie positive du LCR, une imagerie par résonance magnétique (IRM) caractéristique du cerveau et/ou de la colonne vertébrale, ou une combinaison de signes cliniques et de résultats d’IRM évocateurs. Le LCR de ces patients M-LMD a été collecté régulièrement dans le cadre de leurs soins cliniques standard. Aucune procédure n’est effectuée à moins qu’il n’y ait une indication clinique. Le consentement éclairé des patients a été obtenu pour la collecte d’échantillons et leur utilisation à des fins de recherche et de publication. La génération de modèles murins-LMD in vivo a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride du Sud (IACUC# IS00010398). Le schéma général de ce protocole est résumé à la figure 1. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux. 1. Préparation des milieux conditionnés par HMC Pré-enduire un ballon T175 de poly-l-lysine à 2 μg/cm2. Placer le ballon dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h. Aspirer la solution de poly-l-lysine à l’aide d’une pipette sérologique stérile. Il n’est pas nécessaire de rincer le ballon et est prêt pour la culture HMC. Cultiver environ 1,0 x 106 HMC dans 30 mL de milieu de culture complet de méninges (MenCM), qui contient 5 % de sérum fœtal bovin, 1 % de supplément de croissance cellulaire méningée et 100 UI/ml de solution d’antibiotique pénicilline-streptomycine par flacon. Cultivez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire dans des conditions de culture tissulaire standard à 37 °C et 5 % de CO2. Changez de support tous les 3 jours. Lorsque les cellules atteignent une confluence d’environ 75 % à 80 %, prélever et conserver le milieu de culture HMC dans un tube conique de 50 ml. Divisez les HMC en nouveaux flacons T175 et en MenCM complets frais si vous avez besoin de plus de milieux de culture HMC. Au milieu de culture HMC, ajoutez un rapport de 1:1 de MenCM complet. Ajoutez 20 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes (FGF) et 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF), qui deviendront les milieux conditionnés par HMC pour les CTC-LCR.REMARQUE : Il est recommandé d’ajouter du FGF et de l’EGF frais lorsque les CTC sont prêts pour la culture. Stocker les milieux conditionnés HMC dans des aliquotes de 50 mL à 4 °C.REMARQUE : Il est recommandé de stocker les milieux conditionnés au HMC dans des aliquotes à 4 °C mais pas plus de 4 semaines. 2. Collecte du LCR et traitement des échantillons Prérefroidissez la centrifugeuse en la réglant à 4 °C. Une fois prélevé sur le patient, placez immédiatement l’échantillon de LCR dans un tube conique de 15 ml sur de la glace pour le garder frais.REMARQUE : Notre protocole approuvé par l’IRB permet de prélever 7,5 mL de LCR sur le patient consentant. Centrifuger le LCR à 257 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez, conservez et faites des aliquotes du surnageant du LCR sans perturber la cule cellulaire au fond. Les aliquotes surnageantes du LCR peuvent être conservées congelées à -80 °C si nécessaire pour une analyse plus approfondie.REMARQUE : La pastille peut ne pas être visible à l’œil nu ; par conséquent, il est suggéré de laisser ~40-50 μL au fond du tube. Dans le même tube, ajouter 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile pour remettre en suspension et rincer les cellules, puis répéter l’essorage à 257 x g pendant 5 min à 4 °C.REMARQUE : (Facultatif) Effectuez la lyse des globules rouges (GR) si l’échantillon contient une contamination sanguine. Cependant, gardez à l’esprit que certaines cellules peuvent être perdues au cours du processus, y compris les CTC. Les CTC peuvent être propagées sans la procédure de lyse des globules rouges. Retirez et jetez le PBS sans déranger la pastille de cellule, et laissez ~50 μL au fond. Effectuer la numération cellulaire pour déterminer la viabilité cellulaire. À partir de là, il y a deux options pour procéder à la croissance de CTC-LCR : la culture in vitro (étape 3) ou la tentative d’expansion in vivo de xénogreffes dérivées de patients (étape 4).REMARQUE : Si les CTC-LCR doivent être cultivés ultérieurement, cryoconservez les cellules dans un milieu de congélation de culture cellulaire jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la multiplication. Les milieux de congélation de culture cellulaire peuvent être fabriqués en utilisant 90 % de FBS + 10 % de DMSO. S’il y a un excès de LCR (c.-à-d. plus d’un prélèvement de LCR chez les patients ou si le LCR est prélevé à l’autopsie), les CTC peuvent être évalués en soumettant l’échantillon pour le test de dénombrement des CTC17, ou la coloration par immunofluorescence (IF) pour le marqueur de mélanome (c’est-à-dire anti-MLANA), ce qui peut fournir des informations sur la quantité et la viabilité des CTC. Les cellules ne peuvent pas être récupérées après avoir effectué ces expériences. Par conséquent, il n’est pas recommandé s’il n’y a pas d’échantillons de LCR de secours du patient. 3. Culture in vitro et expansion des CTC-LCA Remettre en suspension les LCR-CTC dans des milieux conditionnés par HMC. Si les CTC-LCR sont cryoconservés, décongelez les cellules, essorez-les et lavez-les doucement avec du PBS. Divisez toutes les cellules dans des puits triples dans une plaque de 96 puits avec un volume de 150 μL par puits. Seules les cellules viables adhèrent légèrement à la surface pendant la nuit.REMARQUE : Le nombre de CTC-LCR peut varier considérablement d’un échantillon de patient à l’autre (tableau 1). Pour les patients ayant un faible nombre de CTC, une plaque de 96 puits est utilisée comme point de départ pour la culture, et la pastille entière est plaquée sans compter de peur de perdre des CTC. Cependant, s’il y a une plus grande quantité de LCR (c’est-à-dire obtenue à partir d’une autopsie), il est possible de compter les cellules. Toutes les cellules tumorales ne peuvent pas se développer ex vivo ; Certains se dilateront lentement pendant plusieurs passages avant de devenir statiques. À l’heure actuelle, les chances de succès de la culture ex vivo de CTC-LCR de mélanome sont d’environ 60 %7. Tous les 3 jours, complétez en ajoutant un support frais conditionné au HMC ou retirez délicatement le support en plaçant la pointe de la pipette sur le côté du puits, en laissant un peu de liquide derrière sans perturber le fond du puits, puis remplacez-le par un support frais conditionné au HMC. Lorsque les CTC-LCR ex vivo se dilatent et deviennent confluents à 90 %, trypsiniser et transférer l’ensemble du puits vers un nouveau puits dans une plaque de 24 puits. Lorsque le puits d’un puits de 24 puits est confluent, transférez-le sur une plaque de 12 puits, puis sur une plaque de 6 puits et ainsi de suite.REMARQUE : Après la trypsinisation, envisagez de cryoconserver un petit sous-ensemble de CTC dans des milieux de congélation de culture cellulaire (10 % de DMSO + 90 % de FBS) avant le placage en sauvegarde. Poursuivre la culture des CTC. Certaines cellules peuvent se propager à court terme et finir par devenir statiques. Cependant, un ou plusieurs clones peuvent se transformer et s’étendre de manière exponentielle (Figure 2A). Sélectionnez ces clones, qui deviendront les cultures in vitro de CSF-CTC dérivées de patients (-CSF-CTC).REMARQUE : Si ces clones deviennent surpeuplés ou se regroupent, trypsinisez et replaquez les cellules dans une plaque/fiole de culture de tissus frais. 4. Inoculation in vivo de CTC-LCR pour générer un modèle de xénogreffe dérivée d’une lignée cellulaire (CDX) ou d’un modèle de xénogreffe dérivée du patient (PDX) REMARQUE : Un modèle PDX implique la greffe de cellules cancéreuses directement à partir d’un patient cancéreux (sans culture ex vivo ), tandis que le modèle CDX utilise des lignées cellulaires cancéreuses ou, dans ce cas, des CTC qui ont été propagées et immortalisées18. Utiliser des souris femelles immunodéficientes NOD SCID gamma (NSG) de 6 à 8 semaines pour l’inoculation de CTC-LCR. Les NSG sont utilisés parce qu’ils sont gravement immunodéficients et sont très réceptifs à l’ensemencement de cellules tumorales humaines19. En raison de leurs déficiences immunitaires, ces souris doivent être gardées dans un environnement hygiénique strictement contrôlé et doivent être logées isolées des autres souches de souris. La méthode de rendu murin-LMD a été décrite en détail ailleurs20.REMARQUE : des cellules ex vivo (CTC-LCR des patients qui n’ont été traitées qu’à l’étape 2 sans culture) sont utilisées pour générer le modèle PDX ; l’observation physique de l’animal et l’IRM du cerveau sont nécessaires pour déterminer la progression du LMD. D’autre part, avec le modèle CDX utilisant in vitro, les-CSF-CTC peuvent être marqués avec un rapporteur luciférase, et l’état de la LMD peut être évalué par imagerie bioluminescente (BLI). Le système de marquage cellulaire utilisé dans ce rapport est un rapporteur NanoLuc (NL) qui utilise la furimazine comme substrat, ce qui s’est avéré augmenter la sensibilité proportionnellement à la croissance tumorale21. Aucune interférence de la croissance des cellules CTC (in vitro ou in vivo) par l’expression de NL n’a été observée. Vérifiez les signes de progression du LMD à l’aide des méthodes suivantes : observation physique : perte de poids, inclinaison de la tête et dos voûté. IRM : ventricules hypertrophiés et signes d’hydrocéphalie (Figure 2B). BLI : signaux bioluminescents positifs dans la région du SNC (Figure 2C). 5. Collecte de LCR sur des souris avec LMD pour l’expansion ultérieure du clone Anesthésier la souris NSG avec un LMD avec 4 % d’isoflurane (conformément aux protocoles approuvés par l’établissement) jusqu’à ce qu’elle ne montre aucun signe de réflexe de redressement. Préparez la souris en rasant la fourrure de toute la surface ventrale de la tête et préparez la peau à l’aide d’une technique stérile. Positionnez le nez à l’aide d’un cône nasal en forme de L modifié de l’appareil stéréotaxique, en veillant à ce que les narines ne soient pas obstruées. Fixez la peau en la tirant doucement vers l’avant sur les surfaces ventrales des deux pavillons avec du ruban adhésif, en la fixant au cône nasal, puis en pliant le cou à un angle d’environ 90° après l’avoir fixée. Administrer de l’isoflurane de 1,5 % à 3 % pour maintenir l’anesthésie. En étendant complètement le cou et en commençant juste entre les pavillons, guidez les pointes des ciseaux chirurgicaux vers le bas sur l’os occipital avec une légère pression.REMARQUE : Dans cette position médiane, une dépression subtile est perceptible lorsque les pointes des ciseaux pénètrent dans la zone concave au-dessus de la citerne magna. Créez une petite incision médiane de 5 à 7 mm juste au-dessus de la concavité palpée. Utilisez une pince à pointe émoussée avec des pointes de 1 à 2 mm pour appliquer doucement une pression sur la citerne magna. Introduisez les pointes en position fermée et ouvrez-les tout en exerçant une pression vers le bas sur la dure-mère. Répétez le processus de dissection contondante comme décrit à l’étape 6 jusqu’à ce que la membrane durale soit clairement discernable et que les vaisseaux sanguins associés soient visibles dans la zone exposée. Tout en gardant la pince ouverte pour rétracter la musculature environnante, insérez une aiguille de 27-29 G attachée à une seringue de 1 mL sous la dure-mère pour visualiser le biseau. Assurez-vous que l’aiguille pénètre juste au-delà du biseau. Rétractez progressivement le piston de la seringue. Prélever la plus grande quantité possible de LCR (généralement entre 15 et 30 μL) avant l’euthanasie de la souris.REMARQUE : L’euthanasie est accomplie, selon les protocoles approuvés par l’établissement, en exposant le sujet à des concentrations croissantes de CO2 comprimé. Par exemple, un taux de déplacement de 30 % à 70 % du volume de la chambre par minute sera utilisé pour prévenir ou réduire l’inconfort ou la détresse. Ensuite, on s’assure de l’arrêt des mouvements cardiovasculaires et respiratoires par une observation prolongée à l’air ambiant pendant plus de 10 minutes. Déployez le LCR de la seringue dans un tube de microcentrifugation et placez-le sur de la glace. Faites tourner l’échantillon à 257 x g pendant 5 min à 4 °C et retirez délicatement le liquide (congelez l’échantillon de LCR de souris à -80 °C si nécessaire pour une analyse plus approfondie) sans perturber la pastille cellulaire. Ajouter 500 μL de PBS stérile et laver la pastille de cellule ; Répétez l’essorage à 257 x g pendant 5 min à température ambiante. Remettre en suspension les cellules dans un milieu conditionné HMC dans une plaque à 96 puits.REMARQUE : Les CTC-LCR qui ont été greffés in vivo et cultivés avec succès dans le LMD devraient pouvoir se développer comme des cultures cellulaires normales. Poursuivez votre expansion en changeant de média tous les 3 jours. Trypsiniser et transférer les cellules vers un appareil de culture cellulaire plus grand lorsque les cellules sont confluentes. Ces cellules deviendront les cultures in vivo -CSF-CTC. Dans le rapport actuel, le taux de réussite du modèle CDX était de 100 % et n’a pas encore généré de M-LMD PDX.