生体外 黒色腫関連軟髄膜疾患の研究のための黒色腫患者からの脳脊髄液中の循環腫瘍細胞の培養

匿名化された患者CSF検体の収集は、南フロリダ大学の治験審査委員会(IRB)によって承認されました(MCC 50103、50172、および19332)。M-LMDの患者さんは、CSF細胞診陽性、脳や脊椎の特徴的な磁気共鳴画像法(MRI)、臨床所見と示唆的なMRI所見の組み合わせなど、いくつかの方法で診断されることがあります。これらのM-LMD患者からのCSFは、標準的な臨床ケアの一部として定期的に収集されました。臨床的な適応がない限り、施術は行われません。インフォームドコンセントは、サンプルの収集と研究および出版のためのサンプルの使用のために患者から得られました。 in vivo マウスLMDモデルの作製は、University of South Florida Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC# IS00010398)によって承認されました。このプロトコルの全体的なスキームを 図 1 にまとめます。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。 1. HMCコンディショニング培地の調製 T175フラスコをポリ-l-リジンで2μg/cm2でプレコートします。 フラスコを37°Cのインキュベーターに1時間置きます。 滅菌血清ピペットを使用してポリ-l-リジン溶液を吸引します。フラスコをすすぐ必要はなく、HMC培養の準備ができています。 5% ウシ胎児血清、1% 髄膜細胞増殖サプリメント、フラスコあたり 100 I.U./mL ペニシリン – ストレプトマイシン抗生物質溶液を含む 30 mL の完全髄膜培養培地 (MenCM) で約 1.0 x 10 ×10 6 HMC を培養します。細胞培養インキュベーターで、標準的な組織培養条件(37°C、5%CO2)で細胞を培養します。 メディアは3日ごとに交換します。 細胞が約75%〜80%のコンフルエントに達したら、HMC培養培地を50 mLのコニカルチューブに集めて保存します。 HMC を新しい T175 フラスコと、さらに HMC 培養培地が必要な場合は、新しい完全な MenCM に分割します。 HMC培養培地に、1:1の比率の完全MenCMを添加します。 20 ng/mL の線維芽細胞成長因子 (FGF) と 20 ng/mL の上皮成長因子 (EGF) を添加すると、これが CSF-CTC の HMC コンディショニング培地となります。注:CTCの培養準備ができたら、新しいFGFとEGFを追加することをお勧めします。 HMCコンディショニング培地は、50 mLアリコートに入れて4°Cで保存してください。注:アリコート中のHMCコンディショニング培地は、4°Cで4週間以内に保管することをお勧めします。 2. CSFの収集とサンプル処理 遠心分離機を4°Cに設定して予冷します。 患者から採取したら、CSFサンプルをすぐに氷上の15 mL円錐形チューブに入れて冷まします。注: 当社の IRB 承認プロトコルでは、同意した患者から 7.5 mL の CSF を採取できます。 CSFを257 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 CSF上清を取り出し、保存し、底部の細胞ペレットを乱さずにアリコートを作ります。CSF上清アリコートは、さらなる分析のために必要に応じて-80°Cで凍結保存することができます。注:ペレットは肉眼では見えない場合があります。したがって、チューブの底に ~40-50 μL を残すことをお勧めします。 同じチューブに滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 mLを加えて細胞を再懸濁およびすすぎ、257 x g で4°Cで5分間遠心を繰り返します。注:(オプション)サンプルに血液汚染が含まれている場合は、赤血球(RBC)溶解を行います。ただし、CTCを含む一部の細胞がプロセス中に失われる可能性があることに留意してください。 細胞ペレットを乱さずにPBSを取り出して廃棄し、底に~50μLを残します。 細胞数計数を行い、細胞生存率を決定します。ここから、CSF-CTCの増殖を進めるには、 in vitro 培養(ステップ3)と in vivo 患者由来の異種移植片の拡大を試みる(ステップ4)の2つの選択肢があります。注:CSF-CTCを後で培養する場合は、細胞培養凍結培地で細胞を凍結保存し、増殖の準備ができるまで保存します。細胞培養凍結培地は、90S+10%DMSOを使用して作製できます。過剰なCSFが利用可能な場合(すなわち、患者から複数のCSF採取を受けた場合、または剖検時にCSFが採取された場合)、CTCは、サンプルをCTC計数アッセイ17に提出するか、または免疫蛍光(IF)染色で黒色腫マーカー(すなわち、抗MLANA)に提出することにより評価することができ、これによりCTCの量および生存率に関する洞察が得られる可能性がある。したがって、患者からのバックアップCSFサンプルがない場合は推奨されません。 3. CSF-CTCの in vitro 培養と拡大 HMC コンディショニング媒体中の CSF-CTC を再懸濁します。CSF-CTCを凍結保存する場合は、細胞を解凍して回転させ、PBSでやさしく洗浄します。 ウェルあたり150 μLの容量の96ウェルプレートで、3重ウェルのすべての細胞を分割します。生細胞のみが一晩で表面に軽く付着します。注:CSF-CTCの数は、1人の患者サンプルごとに大きく異なる可能性があります(表1)。CTC数が少ない患者さんには、96ウェルプレートを起点として培養を行い、CTCの損失を恐れてペレット全体をカウントせずに播種します。ただし、CSFの量が多い場合(つまり、剖検から得られた場合)、細胞をカウントすることが可能です。すべての腫瘍細胞が 生体外で増殖できるわけではありません。いくつかは、静止する前にいくつかのパッセージでゆっくりと拡大します。現在、 ex vivo で黒色腫CSF-CTCを成長させることが成功する可能性は約60%7です。 3日ごとに、新しいHMCコンディショニング培地を追加して補充するか、ピペットチップをウェルの側面に置いて培地を静かに取り除き、ウェルの底を乱さずに液体を残してから、新しいHMCコンディショニング培地と交換します。 ex vivo CSF-CTCが拡大して90%コンフルエントになったら、トリプシン化してウェル全体を24ウェルプレートの新しいウェルに移します。24ウェルのウェルがコンフルエントになったら、12ウェルプレートに移し、次に6ウェルプレートに移します。注:トリプシン処理後、バックアップとしてプレーティングする前に、細胞培養凍結培地(10% DMSO + 90% FBS)でCTCの小さなサブセットを凍結保存することを検討してください。 CTCの培養を続けます。一部の細胞は短期間増殖し、最終的には静止する可能性があります。ただし、1 つ以上のクローンが指数関数的に変換および拡張する可能性があります(図 2A)。これらのクローンを選択すると、in vitro患者由来CSF-CTC(PD-CSF-CTC)培養物になります。注:これらのクローンが過密またはクラスター化した場合は、細胞をトリプシン処理し、新鮮な組織培養プレート/フラスコに再播種します。 4. CSF-CTCの in vivo 接種による細胞株由来異種移植片(CDX)または患者由来異種移植片(PDX)モデルの生成 注:PDXモデルは、がん患者から直接がん細胞を生着させる( ex vivo 培養をしない)のに対し、CDXモデルはがん細胞株、またはこの場合は、増殖して不死化されたCTCを使用します18。 CSF-CTCsの接種には、6〜8週間の雌の免疫不全NOD SCIDガンマ(NSG)マウスを使用してください。NSGは、重度の免疫不全であり、ヒト腫瘍細胞の生着を非常に受容性が高いため、使用されます19。これらのマウスは免疫不全のため、厳密に管理された衛生的な環境に保ち、他のマウス系統から隔離して飼育する必要があります。マウスLMDをレンダリングする方法は、他の場所で詳細に説明されている20。注: ex vivo 細胞(ステップ2で培養せずに処理されたのみの患者のCSF-CTC)を使用してPDXモデルを生成します。LMDの進行を判断するには、動物の物理的観察と脳のMRIが必要です。一方、 in vitro を用いたCDXモデルでは、PD-CSF-CTCをルシフェラーゼレポーターで標識し、生物発光イメージング(BLI)によりLMDの状態を評価することができます。この報告で使用した細胞標識システムは、フリマジンを基質として利用するNanoLuc(NL)レポーターであり、腫瘍の成長に比例して感度が向上することが示されています21。NL発現によるCTC細胞増殖(in vitro または in vivo)の干渉は観察されませんでした。 これらの方法を使用してLMD進行の兆候を確認します:物理的観察:体重減少、頭の傾き、猫背。MRI:脳室の拡大と水頭症の徴候(図2B)。BLI:CNS領域における正の生物発光シグナル(図2C)。 5. LMDを用いたマウスからのCSF採取によるその後のクローン増殖 NSG マウスに 4% イソフルラン (制度的に承認されたプロトコルに従う) を含む LMD で麻酔をかけ、立ち直反射の兆候がなくなるまで麻酔します。 頭の腹面全体の毛皮を剃ってマウスを調製し、滅菌技術を使用して皮膚を準備します。 定位装置の改良型L字型ノーズコーンを使用して鼻を配置し、鼻孔が遮られないようにします。皮膚をテープで両方の耳介の腹面を横切って前方にそっと引っ張ってノーズコーンに貼り付け、固定した後、首を約90°の角度で曲げて固定します。.麻酔を維持するために1.5%〜3%のイソフルランを投与します。 首を完全に伸ばし、耳介の間から始めて、わずかな圧力で手術用ハサミの先端を後頭骨を横切って下向きに導きます。注:この正中線位置では、はさみの先端が大槽の上の凹面領域に入ると、微妙なくぼみが識別できます。 触診された凹面のすぐ上に5〜7mmの小さな正中線切開を作成します。 先端が1〜2mmの鈍い先端の鉗子を使用して、大槽に優しく圧力をかけます。閉じた位置にチップを導入し、硬膜に下向きの圧力をかけながら開きます。 ステップ6で概説したように、硬膜がはっきりと識別でき、露出領域内に関連する血管が見えるまで、鈍的解剖プロセスを繰り返します。 鉗子を開いたままにして周囲の筋肉組織を引っ込めながら、1mLのシリンジに取り付けられた27〜29Gの針を硬膜の下に挿入して、斜角を視覚化します。針がベベルのすぐ向こうに貫通していることを確認します。シリンジプランジャーを徐々に引っ込めます。 マウスの安楽死の前に、できるだけ多くのCSF(通常は15〜30μL)を収集します。注:安楽死は、施設で承認されたプロトコルに従って、被験者を圧縮されたCO2 ガスの濃度の上昇にさらすことによって達成されます。例えば、毎分チャンバー容積の30%から70%までの変位率が、不快感や苦痛を予防または軽減するために使用されます。これに続いて、室内の空気中で10分以上長時間観察することにより、心血管運動と呼吸運動の停止を確保します。 シリンジからCSFをマイクロ遠心チューブに展開し、氷の上に置きます。 サンプルを257 x g で5分間、4°Cで遠心し、細胞ペレットを乱さずに液体を静かに取り除きます(さらに分析するためにマウスCSFサンプルを-80°Cで凍結します)。 滅菌PBS500μLを添加し、細胞ペレットを洗浄します。257 x g で室温で5分間回転を繰り返します。 HMCコンディショニング培地中の細胞を96ウェルプレートに再懸濁します。注: in vivo で生着され、LMDに正常に増殖したCSF-CTCは、正常な細胞培養と同様に増殖できるはずです。3日ごとにメディアを交換して拡大を続けます。細胞がコンフルエントになったら、細胞をトリプシン化し、より大きな細胞培養装置に移します。これらの細胞は、 in vivo PD-CSF-CTC 培養物になります。今回のレポートでは、CDXモデルの成功率は100%で、PDX M-LMDはまだ生成されていません。