Fare Miyoblast Araştırmalarında Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme (CUT & Tag) Testinin Kullanılması
Summary
Epigenetik alanda yeni olan araştırmacılar, CUT & Tag’i ChIP tahlillerine göre önemli ölçüde daha kolay bir alternatif bulacaklar. CUT & Tag, nadir ve birincil hücre popülasyonları üzerindeki epigenetik çalışmalardan büyük ölçüde yararlandı ve çok az hücreden yüksek kaliteli veriler üretti. Bu protokol, fare arka bacak kaslarından izole edilen fare miyoblastları üzerinde H3K4me1 CUT & Tag testlerinin gerçekleştirilmesini açıklar.
Abstract
Bu protokol belgesi, yeni araştırmacılara, kromatin bağlanma faktörlerinin, histon işaretlerinin ve histon varyantlarının genomik konumlarını profillemek için Hedefler ve Etiketleme Altında Bölünme (CUT & Tag) kullanmanın tüm ayrıntılarını sağlamayı amaçlamaktadır. CUT & Tag protokolleri, fare miyoblastları ve yeni izole edilmiş kas kök hücreleri (MuSC’ler) ile çok iyi çalışır. Hücreler Concanavalin-A boncukları ile hareketsiz hale getirilebildiği sürece diğer birçok hücre tipine kolayca uygulanabilirler. CUT & Tag ile karşılaştırıldığında, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testleri zaman alıcı deneylerdir. ChIP tahlilleri, kromatik malzeme immünopresipitasyon için kullanılmadan önce kromatinin ön işlemini gerektirir. Çapraz bağlama ChIP’de (X-ChIP), kromatinin ön işlemi, kromatini parçalamak için çapraz bağlama ve sonikasyonu içerir. Doğal ChIP (N-ChIP) durumunda, parçalanmış kromatinler normal olarak Mikrokokal nükleaz (MNaz) sindirimi ile elde edilir. Hem sonikasyon hem de MNase sindirimi, ChIP deneylerine bazı önyargılar getirir. CUT & Tag tahlilleri, ChIP’lere kıyasla daha az adımda tamamlanabilir ve çok daha az hücre gerektirebilir, ancak çeşitli genomik konumlardaki transkripsiyon faktörleri veya histon işaretleri hakkında daha tarafsız bilgi sağlar. CUT & Tag, 5.000 hücreye kadar çalışabilir. ChIP’lerden daha yüksek hassasiyeti ve daha düşük arka plan sinyali nedeniyle, araştırmacılar sıralamadan sonra yalnızca birkaç milyon okumadan güvenilir tepe verileri elde etmeyi bekleyebilirler.
Introduction
CUT & Tag testi, ChIP’lerin bazı açık kusurlarını telafi etmek için icat edildi1. ChIP’lerin iki ana dezavantajı, 1) kromatini parçalarken ortaya çıkan önyargı ve 2) düşük hücre sayılarıyla çalışma beceriksizliğidir. X-ChIP tahlilleri, kromatin fragmanlarını elde etmek için sonikasyon veya MNaz sindirimine dayanırken, N-ChIP, nükleozomları elde etmek için çoğunlukla MNaz sindirimini kullanır. Sonikasyon, promotör bölgeler2 gibi rahat kromatin konumlarına karşı bir önyargı gösterir ve görünüşe göre, MNase sindirimi de gevşemiş kromatin lifleri üzerinde daha verimli çalışır. Ayrıca, bazıları MNaz sindiriminin de DNA dizisine bağlı bir önyargı gösterdiğini bildirmiştir3. Bu nedenle, ChIP tahlillerinin girdi hazırlama adımında, her türlü genomik konumdan kromatin fragmanlarını tamamen rastgele bir şekilde elde etmek imkansızdır. Ayrıca, ChIP tahlilleri normalde CUT & Tag’e kıyasla daha yüksek arka plan sinyalleri üretir ve tepe noktalarının 1,4,5 olduğu yerleri vurgulamak için CUT & Tag’den 10 kat daha fazla okuma gerektirir. Bu, ChIP deneylerinin neden CUT & Tag’den çok daha fazla hücre ile başlaması gerektiğini açıklıyor. Hücre dizilerini incelerken bu bir sorun değildir, çünkü çok yüksek bir hücre sayısı elde etmek için tekrar tekrar geçilebilirler. Bununla birlikte, ChIP testi, nadir veya değerli birincil hücre popülasyonlarını incelemek için kesinlikle güçlü bir epigenetik araç değildir, ancak birincil hücreler açıkça daha pratik ve tıbbi etkilere sahiptir.
Uzun ve karmaşık ChIP prosedürü, bazı araştırmacıları bu tekniği öğrenmekten veya kullanmaktan caydırırken, insanlar immünositokimya (ICC) veya immünofloresan (IF) gibi daha kolay tahlillerle daha rahattır. Bir CUT & Tag testi, esasen ICC ve IF deneylerinin sürecine benzer, ancak yalnızca bir test tüpünde gerçekleşir. CUT & Tag, başlamak için parçalanmış kromatine ihtiyaç duymaz ve bunun yerine, antikor bağlanması için genomun sağlam olması gerekir1. Bir ChIP deneyinin ilk gününde, araştırmacılar normalde, kısa kromatin parçaları antikor-boncuklar 4,5 ile karıştırılmadan önce, sonikasyon veya MNaz sindirimi ile çekirdeklerden parçalanmış kromatinleri hazırlamak için 4 saate kadar harcarlar. Dikkate değer bir tezat olarak, bir CUT & Tag prosedürünün ilk gün iş yükü, hücreleri sadece Concanavalin-A boncuklarına hareketsiz hale getirmek ve daha sonra birincil antikoru hücre boncuklarına eklemektir. Bu sadece ~ 40 dakikagerektirir 1.
Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease’in (CUT&RUN) CUT&Tag’e önemli bir alternatif olduğunu belirtmekte fayda var. CUT&RUN, CUT&TAG ile benzer bir çalışma mekanizması üzerine kurulmuştur. CUT & Tag’de, antikorlar pA / G-Tn5 transpozazı, enzimin her birinin bir kromatin parçasını keseceği ve bu arada kütüphane yapma adaptörleri ile etiketleyeceği tüm yerlere yönlendirirken, CUT & RUN’da pA / G-Tn5’in rolü, işin sadece kesme kısmını gerçekleştiren pA / G-MNaz tarafından oynanır6. Bu nedenle, CUT & Tag ile karşılaştırıldığında, CUT & RUN, kütüphane oluşturma adaptörlerini pA / G-MNaz parçalanmış DNA parçalarınayapıştırmak için ek bir adım gerektirir 7,8. CUT & Tag ve CUT & Run arasındaki yüksek benzerlikler nedeniyle, CUT & Tag’e aşina olan araştırmacılar, CUT & RUN’ı yetkin bir şekilde gerçekleştirmeye kendilerini kolayca adapte edeceklerdir. Ancak, CUT & Tag ve CUT & RUN arasında bazı küçük farklılıklar olduğuna dikkat edilmelidir. CUT & RUN protokolleri normalde yıkama adımlarında fiziksel tuz konsantrasyonunu (~ 150 mM) kullanırken, CUT & Tag’de 300 Dig yıkama tamponunun tuzu yüksektir. Bu nedenle, CUT & Tag, histon işaretlerinin / varyantlarının veya transkripsiyon faktörlerinin profilini çıkarırken arka planı kontrol etmede iyidir, çünkü bu proteinler DNA1’i doğrudan ve güçlü bir şekilde bağlar. CUT & Tag, DNA’yı doğrudan bağlamayan ve kromatine zayıf afinite gösteren kromatinle ilişkili faktörlerin profilini çıkarırken sorunlarla karşılaşabilir. CUT & Tag’deki yüksek tuzlu yıkama adımları, kromatinle ilişkili faktörleri sıyırabilir ve nihai çıktıda sinyal olmamasına neden olabilir. CUT & Tag’in bazı histon olmayan / transkripsiyon olmayan faktör proteinlerini9 profillemek için kullanılabileceği başarılı durumlar olmasına rağmen, zayıf bağlı kromatinle ilişkili proteinleri profillemek için CUT & Tag yerine CUT & RUN’ı öneriyoruz.
Memeliler yetişkinliğe ulaştıktan sonra, iskelet kası dokuları hala kas kök hücreleri içerir. Kas yaralanması sırasında, bu kök hücreler aktive edilebilir ve hasarlı kas liflerini yeniden oluşturmak için hücre sayısı genişlemesi ve farklılaşmasına uğrayabilir10. Bu kök hücreler Kas kök/uydu hücreleri (MuSC’ler) olarak bilinir. MuSC’ler hayvanlardan izole edildikten veya kas yaralanması ile aktive edildikten sonra çoğalmaya başlarlar ve miyoblast haline gelirler.
Fare iskelet kası sindiriminden MuSC’leri elde etmek için, Vcam1 (Cd106), Cd34 ve α7-integrin (Itga7) gibi MuSC yüzey belirteçleri, floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) sırasında MuSC’leri zenginleştirmek için genellikle tek tek veya kombinasyonlar halinde kullanılır11. Cd31–/Cd45–/Sca1–/Vcam1+ ‘nın muhtemelen %>95 saf MuSC’ler elde etmek için en iyi belirteç kombinasyonu olduğu gösterilmiştir12. FACS, taze kaslar sindirildikten hemen sonra saf MuSC’leri izole edebilir. Bununla birlikte, deneysel tasarım, izolasyonlarında saf MuSC’ler gerektirmiyorsa, ön kaplama, %>90 saf miyoblastlar (MuSC soyu) elde etmek için FACS’den daha uygun maliyetlidir.
Farelerden yeni izole edilen MuSC’ler, fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Ham’ın F10 ortamında verimli bir şekilde çoğalmaz. MuSC’lerin hücre sayısını daha iyi genişletmek ve yeterli miyoblast elde etmek için, FBS yerine sığır büyüme serumu (BGS) kullanılmalıdır. Bununla birlikte, BGS mevcut değilse, Ham’ın F10 tam ortamı (yaklaşık% 20 FBS içerir), miyoblast genişlemesini önemli ölçüde teşvik etmek için eşit hacimde T hücresi koşullu ortam ile karıştırılabilir13. Bu nedenle, bu protokol aynı zamanda T-hücresi ortamı koşullandırılmış MuSC ortamının hazırlanmasını da tanımlayacaktır.
En önemlisi, bu protokol, fare arka bacak kaslarından izole edilen fare miyoblastları üzerinde H3K4me1 CUT & Tag testlerinin gerçekleştirilmesinin tam bir örneğini sağlar. Lütfen bu protokolün diğer hücre tipleri, histon işaretleri ve histon varyantları için de geçerli olduğunu ve okuyucuların yalnızca inceledikleri spesifik histon işaretlerinin veya varyantlarının zenginleşmesine dayalı olarak vakaları için hücre sayılarını veya antikor miktarlarını optimize etmeleri gerektiğini unutmayın.
CUT & Tag veya CUT & RUN’da kullanılabilmesi için, Tn5 veya MNase’nin pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase veya pG-MNase yapmak için protein A veya protein G ile kaynaştırılması gerekir. Görünüşe göre, hem protein A hem de protein G, pA / G-Tn5 veya pA / G-MNaz üretmek için bu enzimler üzerine aynı anda kaynaştırılabilir. Protein A ve protein G, farklı türlerden IgG’lere farklı afiniteler gösterir. Bu nedenle, protein A ve protein G’yi tamamen enzim üzerine kaynaştırmak bu sorunun üstesinden gelebilir ve enzimi birden fazla türden gelen antikorlarla uyumlu hale getirebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belirli bir CUT & Tag reaksiyonunda gerekli olan spesifik hücre sayısı, tamamen test edilecek histon işaretlerinin / varyantlarının veya kromatin bağlayıcı proteinlerin zenginleştirilmesine dayanır. Normalde H3K4me1, H3K4me3 ve H3K27ac gibi çok zenginleştirilmiş histon işaretleri için 25.000-50.000 miyoblast bir CUT & Tag reaksiyonu için oldukça yeterlidir. Bununla birlikte, bazı nadir kromatin bağlayıcı proteinler 250.000’e kadar hücre gerektirebilir. CUT & Tag tahlillerinde kullanılan hücre say…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Bilim Akademisi’nin Stratejik Öncelikli Araştırma Programı (PH’ye XDA16020400) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (PH’ye 32170804).
Materials
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004177 | |
| Concanavalin-A | Sigma-Aldrich | C5275 | |
| Concanavalin-A beads | Bangs Laboratories | BP531 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 300410 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| H3K4me1 antibody | abcam | ab8895 | |
| Ham's F10 media | Thermo Fisher Scientific | 11550043 | |
| Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina | Vazyme | TD903 | This kit has been tested by us to function well |
| Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes | Qualityard | QYM06 | |
| Magnetic rack for 8-PCR tube stripes | Anosun Magnetic | CLJ16/21-021 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | NEB | M0541L | For library-making PCR reaction |
| pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | Needs to be mounted with adaptors before use |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| Proteinase K | Beyotime | ST535-100mg | |
| RPMI-1640 media | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) | Antibodies-online | ABIN101961 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | |
| TruePrep Index Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD202 | This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | N411 | Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size |
References
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).
- Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLife. 4, e09225 (2015).
- Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
- Policastro, R. A., Zentner, G. E. Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites. Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, e21856 (2017).
- Mezger, A., et al. High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution. Nat Commun. 9, 3647 (2018).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8, 14049 (2017).
- Nakka, K., et al. JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment. Science. 377 (6606), 666-669 (2022).
- Fu, X., Wang, H., Hu, P. Stem cell activation in skeletal muscle regeneration. Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skelet Muscle. 6, 35 (2016).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).
- Fu, X., et al. Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion. Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).
- Li, Y., et al. Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag. STAR Protoc. 2 (3), 100751 (2021).
- Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).
- Wardle, F. C. Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod. J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).
- Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Faralli, H., et al. UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration. J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).
- Yang, J. H., et al. Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).
