Использование анализа расщепления под мишенями и тегирования (CUT&Tag) в исследовании миобластов мышей

Тест CUT&Tag был изобретен для компенсации некоторых явных недостатков ChIPs¹. Двумя основными недостатками ChIPs являются: 1) смещение, возникающее при фрагментации хроматина, и 2) неспособность работать с малым числом клеток. Анализы X-ChIP основаны либо на ультразвуковом расщеплении, либо на расщеплении MNазы для получения фрагментов хроматина, в то время как N-ChIP в основном использует расщепление MNазы для получения нуклеосом. Ультразвуковая обработка показывает смещение в сторону ослабленных мест расположения хроматина, таких как промоторные области², и, по-видимому, переваривание МНазы также более эффективно работает на расслабленных волокнах хроматина. Более того, некоторые сообщили, что расщепление MNазы также показывает смещение, зависящее от последовательности ДНК³. Таким образом, на этапе подготовки входных данных анализов ChIP невозможно получить фрагменты хроматина из всех видов геномных участков совершенно случайным образом. Кроме того, анализы ChIP обычно генерируют более высокие фоновые сигналы по сравнению с CUT&Tag и требуют более чем в 10 раз больше прочтений, чем CUT&Tag, чтобы подчеркнуть, где находятся пики ^1,4,5. Это объясняет, почему эксперименты с ChIP должны начинаться с гораздо большим количеством клеток, чем в CUT&Tag. Это не является проблемой при изучении клеточных линий, поскольку они могут многократно проходить для достижения очень высокого числа клеток. Тем не менее, анализ ChIP определенно не является сильным эпигенетическим инструментом для изучения редких или ценных популяций первичных клеток, хотя первичные клетки, очевидно, имеют более практическое и медицинское значение.

В то время как длительная и сложная процедура ChIP отпугивает некоторых исследователей от изучения или использования этого метода, люди более комфортно чувствуют себя с более простыми анализами, такими как иммуноцитохимия (ICC) или иммунофлуоресценция (IF). Анализ CUT&Tag по сути напоминает процесс экспериментов ICC и IF, но проводится только в пробирке. CUT&Tag не нуждается в фрагментированном хроматине, а вместо этого геном должен быть интактным для связывания антител¹. В первый день эксперимента ChIP исследователи обычно тратят до 4 часов на подготовку фрагментированных хроматинов из ядер с помощью ультразвука или МНазы, прежде чем короткие кусочки хроматина могут быть смешаны с антителами-гранулами ^4,5. В отличие от этого, рабочая нагрузка первого дня процедуры CUT&Tag заключается в том, чтобы просто обездвижить клетки до гранул Конканавалина-А, а затем добавить первичное антитело к клеточным гранулам. Для этого требуется всего ~40 мин¹.

Стоит отметить, что расщепление под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы (CUT&RUN) является важной альтернативой CUT&TAG. CUT&RUN был создан на основе того же рабочего механизма, что и CUT&TAG. В CUT&TAG антитела направляют транспоназу pA/G-Tn5 во все места, где каждый фермент вырезает кусок хроматина и тем временем помечает его адаптерами для создания библиотек, в то время как в CUT&RUN роль pA/G-Tn5 играет pA/G-MNase, которая выполняет только режущую часть работы⁶. Таким образом, по сравнению с CUT&Tag, CUT&RUN требует дополнительного этапа, который заключается в приклеивании адаптеров, создающих библиотеку, к фрагментированным фрагментам ДНК pA/G-MNase ^7,8. Благодаря большому сходству между CUT&Tag и CUT&RUN, исследователи, знакомые с CUT&TAG, легко адаптируются к профессиональному выполнению CUT&RUN. Тем не менее, следует отметить, что между CUT&Tag и CUT&RUN существуют некоторые незначительные различия. В протоколах CUT&RUN обычно используется физическая концентрация соли (~150 мМ) на этапах промывки, в то время как в CUT&TAG буфер для промывки 300-Dig имеет высокое содержание соли. Таким образом, CUT&Tag хорошо контролирует фон при профилировании гистоновых меток/вариантов или факторов транскрипции, поскольку эти белки напрямую и прочно связываются с ДНК¹. CUT&Tag может столкнуться с проблемами при профилировании хроматин-ассоциированных факторов, которые не связываются напрямую с ДНК и демонстрируют слабое сродство к хроматину. Этапы промывки с высоким содержанием соли в CUT&Tag могут удалять факторы, связанные с хроматином, и не вызывать никаких сигналов на выходе. Несмотря на то, что существуют успешные случаи, когда CUT&Tag может быть использован для профилирования некоторых белков, не содержащих гистон и нетранскрипционный фактор⁹, мы все же рекомендуем использовать CUT&RUN вместо CUT&Tag для профилирования слабо связанных хроматин-ассоциированных белков.

После того, как млекопитающие достигают взрослого возраста, их скелетные мышечные ткани все еще содержат мышечные стволовые клетки. Во время мышечной травмы эти стволовые клетки могут быть активированы и подвергнуться увеличению и дифференцировке клеток для^{регенерации} поврежденных мышечных волокон. Эти стволовые клетки известны как мышечные стволовые/сателлитные клетки (MuSCs). После того, как MuSC выделены у животных или активированы при мышечной травме, они начинают пролиферировать и становятся миобластами.

Для получения MuSC из переваривания скелетных мышц мышей поверхностные маркеры MuSC, такие как Vcam1 (Cd106), Cd34 и α7-интегрин (Itga7), часто используются по отдельности или в комбинациях для обогащения MuSC во время флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS)¹¹. Было показано, что Cd31^–/Cd45^–/Sca1^–/Vcam1⁺ является, вероятно, лучшей комбинацией маркеров для получения >95% чистых MuSCs¹². FACS может выделять чистые MuSC сразу после переваривания свежих мышц. Однако, если в экспериментальном дизайне не требуются чистые MuSC непосредственно при их выделении, предварительное покрытие является более экономически эффективным, чем FACS, для получения >90% чистых миобластов (потомство MuSC).

MuSC, только что выделенные от мышей, не пролиферируют эффективно в среде F10 Хама, дополненной фетальной бычьей сывороткой (FBS). Чтобы лучше увеличить количество клеток MuSCs и получить достаточное количество миобластов, вместо FBS следует использовать сыворотку роста крупного рогатого скота (BGS). Однако, если BGS недоступна, полную среду F10 Ham (содержащую около 20% FBS) можно смешивать с равным объемом Т-клеточной условной среды для значительного увеличения миобласта¹³. Таким образом, в данном протоколе будет также описано получение Т-клеточных сред, кондиционированных MuSC.

Самое главное, что этот протокол представляет собой полный пример проведения анализов H3K4me1 CUT&Tag на мышиных миобластах, выделенных из мышц задних конечностей мыши. Обратите внимание, что этот протокол также применяется к другим типам клеток, гистоновым меткам и вариантам гистонов, и читателям необходимо оптимизировать только количество клеток или антител для своих случаев на основе обогащения конкретных гистоновых меток или вариантов, которые они изучают.

Для использования в CUT&Tag или CUT&RUN Tn5 или MNaза должна быть слита с белком A или белком G для получения pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase или pG-MNase. По-видимому, и белок А, и белок G могут быть слиты с этими ферментами одновременно для получения pA/G-Tn5 или pA/G-MNase. Белок А и белок G демонстрируют дифференциальное сродство к IgG разных видов. Таким образом, слияние белка А и белка G с ферментом может решить эту проблему и сделать фермент совместимым с антителами нескольких видов.