Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

O ensaio CUT&Tag foi inventado para compensar algumas falhas evidentes dos ChIPs¹. As duas principais desvantagens dos ChIPs são 1) o viés introduzido ao fragmentar a cromatina e 2) a incompetência para trabalhar com baixo número de células. Os ensaios X-ChIP dependem da sonicação ou da digestão da MNase para obter fragmentos de cromatina, enquanto o N-ChIP usa principalmente a digestão da MNase para obter nucleossomos. A sonicação mostra um viés para locais de cromatina relaxados, como regiões promotoras² e, aparentemente, a digestão da MNase também funciona de forma mais eficiente em fibras de cromatina relaxadas. Além disso, alguns relataram que a digestão da MNase também mostra um viés dependente da sequência de DNA³. Portanto, na etapa de preparação de entrada dos ensaios ChIP, é impossível obter fragmentos de cromatina de todos os tipos de locais genômicos de maneira perfeitamente aleatória. Além disso, os ensaios ChIP normalmente geram sinais de fundo mais altos em comparação com o CUT&Tag e exigem mais de 10 vezes mais leituras do que o CUT&Tag para acentuar onde os picos são ^1,4,5. Isso explica por que os experimentos ChIP têm que começar com tremendamente mais células do que o CUT&Tag. Isso não é um problema ao estudar linhagens celulares, pois elas podem ser passadas repetidamente para atingir um número de células muito alto. No entanto, o ensaio ChIP definitivamente não é uma ferramenta epigenética forte para estudar populações de células primárias raras ou preciosas, embora as células primárias obviamente tenham implicações mais práticas e médicas.

Embora o longo e complicado procedimento ChIP desencoraje alguns pesquisadores de aprender ou usar essa técnica, as pessoas se sentem mais confortáveis com ensaios mais fáceis, como imunocitoquímica (ICC) ou imunofluorescência (IF). Um ensaio CUT&Tag se assemelha essencialmente ao processo de experimentos ICC e IF, mas ocorre apenas em um tubo de ensaio. O CUT&Tag não precisa de cromatina fragmentada para começar e, em vez disso, o genoma deve estar intacto para a ligação do anticorpo¹. No primeiro dia de um experimento ChIP, os pesquisadores normalmente gastam até 4 h preparando as cromatinas fragmentadas dos núcleos com sonicação ou digestão de MNase antes que os pedaços curtos de cromatina possam ser misturados com grânulos de anticorpos ^4,5. Em contraste notável, a carga de trabalho do primeiro dia de um procedimento CUT & Tag é apenas imobilizar as células para os grânulos de concanavalina A e, em seguida, adicionar o anticorpo primário aos grânulos celulares. Isso requer apenas ~ 40 min¹.

Vale ressaltar que o Clivage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN) é uma alternativa importante ao CUT&Tag. O CUT&RUN foi estabelecido com base em um mecanismo de trabalho semelhante ao CUT&Tag. No CUT&Tag, os anticorpos guiam a transposase pA/G-Tn5 para todos os locais onde a enzima cortará um pedaço de cromatina e, enquanto isso, o marcará com adaptadores de criação de bibliotecas, enquanto no CUT&RUN, o papel de pA/G-Tn5 é desempenhado pela pA/G-MNase, que executa apenas a parte de corte do trabalho⁶. Portanto, em comparação com o CUT&Tag, o CUT&RUN requer uma etapa adicional que é colar os adaptadores de criação de bibliotecas nas peças de DNA fragmentadas por pA/G-MNase ^7,8. Devido às altas semelhanças entre o CUT&Tag e o CUT&RUN, os pesquisadores familiarizados com o CUT&Tag se adaptarão facilmente para realizar o CUT&RUN com proficiência. No entanto, deve-se notar que existem algumas pequenas diferenças entre o CUT&Tag e o CUT&RUN. Os protocolos CUT&RUN normalmente usam a concentração física de sal (~150 mM) nas etapas de lavagem, enquanto no CUT&Tag, o tampão de lavagem 300-Dig é rico em sal. Portanto, o CUT&Tag é bom para controlar o fundo ao traçar o perfil de marcas/variantes de histonas ou fatores de transcrição, pois essas proteínas se ligam direta e fortemente ao DNA¹. A CUT&Tag pode ter problemas ao traçar o perfil de fatores associados à cromatina que não se ligam diretamente ao DNA e mostram fraca afinidade com a cromatina. Etapas de lavagem com alto teor de sal no CUT&Tag podem remover fatores associados à cromatina e não causar sinais na saída final. Embora existam casos bem-sucedidos em que o CUT&Tag pode ser usado para traçar o perfil de^{algumas proteínas 9} não histonas/não fator de transcrição, ainda recomendamos o CUT&RUN em vez do CUT&Tag para traçar o perfil de proteínas associadas à cromatina fracamente ligadas.

Depois que os mamíferos atingem a idade adulta, seus tecidos musculares esqueléticos ainda contêm células-tronco musculares. Durante a lesão muscular, essas células-tronco podem ser ativadas e sofrer expansão e diferenciação do número de células para regenerar as fibras musculares danificadas¹⁰. Essas células-tronco são conhecidas como células-tronco / satélites musculares (MuSCs). Depois que os MuSCs são isolados de animais ou uma vez ativados por lesão muscular, eles começam a proliferar e se tornam mioblastos.

Para obter MuSCs da digestão do músculo esquelético de camundongos, marcadores de superfície MuSC como Vcam1 (Cd106), Cd34 e α7-integrina (Itga7) são frequentemente usados individualmente ou em combinações para enriquecer MuSCs durante a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) ¹¹ . Foi demonstrado que Cd31^–/Cd45^–/Sca1^–/Vcam1⁺ é provavelmente a melhor combinação de marcadores para obter MuSCs >95% puros¹². O FACS pode isolar MuSCs puros logo após a digestão dos músculos frescos. No entanto, se o projeto experimental não exigir MuSCs puros logo em seu isolamento, o pré-plaqueamento é mais econômico do que o FACS para obter mioblastos >90% puros (progênie MuSC).

MuSCs recém-isolados de camundongos não proliferam eficientemente em meio F10 de Ham suplementado com soro fetal bovino (FBS). Para expandir melhor o número de células de MuSCs e obter mioblastos suficientes, deve-se usar soro de crescimento bovino (BGS) em vez de FBS. No entanto, se o BGS não estiver disponível, o meio completo F10 de Ham (contendo cerca de 20% de FBS) pode ser misturado com um volume igual de meio condicional de células T para promover drasticamente a expansão do mioblasto¹³. Portanto, este protocolo também descreverá a preparação de meios MuSC condicionados por meio de células T.

Mais importante ainda, este protocolo fornece um exemplo completo da realização de ensaios H3K4me1 CUT&Tag em mioblastos de camundongos isolados de músculos dos membros posteriores de camundongos. Observe que este protocolo também se aplica a outros tipos de células e marcas de histonas e variantes de histonas, e os leitores só precisam otimizar o número de células ou quantidades de anticorpos para seus casos com base no enriquecimento das marcas ou variantes de histonas específicas que estudam.

Para ser usado no CUT&Tag ou CUT&RUN, o Tn5 ou MNase precisa ser fundido com a proteína A ou proteína G para produzir pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase ou pG-MNase. Aparentemente, tanto a proteína A quanto a proteína G podem ser fundidas nessas enzimas ao mesmo tempo para gerar pA/G-Tn5 ou pA/G-MNase. A proteína A e a proteína G apresentam afinidades diferenciais com IgGs de diferentes espécies. Portanto, a fusão da proteína A e da proteína G na enzima pode superar esse problema e tornar a enzima compatível com anticorpos de várias espécies.