Summary

Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Pesquisadores novos no campo epigenético encontrarão no CUT&Tag uma alternativa significativamente mais fácil aos ensaios ChIP. A CUT&Tag beneficiou tremendamente os estudos epigenéticos em populações de células raras e primárias, gerando dados de alta qualidade a partir de muito poucas células. Este protocolo descreve a realização de ensaios H3K4me1 CUT&Tag em mioblastos de camundongos isolados de músculos posteriores de camundongos.

Abstract

Este artigo de protocolo tem como objetivo fornecer aos novos pesquisadores todos os detalhes do uso de Clivagem sob Alvos e Tagmentação (CUT&Tag) para traçar o perfil das localizações genômicas de fatores de ligação à cromatina, marcas de histonas e variantes de histonas. Os protocolos CUT&Tag funcionam muito bem com mioblastos de camundongos e células-tronco musculares (MuSCs) recém-isoladas. Eles podem ser facilmente aplicados a muitos outros tipos de células, desde que as células possam ser imobilizadas por contas de Concanavalina-A. Em comparação com o CUT&Tag, os ensaios de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) são experimentos demorados. Os ensaios ChIP requerem o pré-tratamento da cromatina antes que o material cromático possa ser usado para imunoprecipitação. Na reticulação ChIP (X-ChIP), o pré-tratamento da cromatina envolve reticulação e sonicação para fragmentar a cromatina. No caso do ChIP nativo (N-ChIP), as cromatinas fragmentadas são normalmente obtidas pela digestão da nuclease microcócica (MNase). Tanto a sonicação quanto a digestão da MNase introduzem algum viés nos experimentos ChIP. Os ensaios CUT&Tag podem ser concluídos em menos etapas e requerem muito menos células em comparação com os ChIPs, mas fornecem informações mais imparciais sobre fatores de transcrição ou marcas de histonas em vários locais genômicos. O CUT&Tag pode funcionar com apenas 5.000 células. Devido à sua maior sensibilidade e menor sinal de fundo do que os ChIPs, os pesquisadores podem esperar obter dados de pico confiáveis de apenas alguns milhões de leituras após o sequenciamento.

Introduction

O ensaio CUT&Tag foi inventado para compensar algumas falhas evidentes dos ChIPs1. As duas principais desvantagens dos ChIPs são 1) o viés introduzido ao fragmentar a cromatina e 2) a incompetência para trabalhar com baixo número de células. Os ensaios X-ChIP dependem da sonicação ou da digestão da MNase para obter fragmentos de cromatina, enquanto o N-ChIP usa principalmente a digestão da MNase para obter nucleossomos. A sonicação mostra um viés para locais de cromatina relaxados, como regiões promotoras2 e, aparentemente, a digestão da MNase também funciona de forma mais eficiente em fibras de cromatina relaxadas. Além disso, alguns relataram que a digestão da MNase também mostra um viés dependente da sequência de DNA3. Portanto, na etapa de preparação de entrada dos ensaios ChIP, é impossível obter fragmentos de cromatina de todos os tipos de locais genômicos de maneira perfeitamente aleatória. Além disso, os ensaios ChIP normalmente geram sinais de fundo mais altos em comparação com o CUT&Tag e exigem mais de 10 vezes mais leituras do que o CUT&Tag para acentuar onde os picos são 1,4,5. Isso explica por que os experimentos ChIP têm que começar com tremendamente mais células do que o CUT&Tag. Isso não é um problema ao estudar linhagens celulares, pois elas podem ser passadas repetidamente para atingir um número de células muito alto. No entanto, o ensaio ChIP definitivamente não é uma ferramenta epigenética forte para estudar populações de células primárias raras ou preciosas, embora as células primárias obviamente tenham implicações mais práticas e médicas.

Embora o longo e complicado procedimento ChIP desencoraje alguns pesquisadores de aprender ou usar essa técnica, as pessoas se sentem mais confortáveis com ensaios mais fáceis, como imunocitoquímica (ICC) ou imunofluorescência (IF). Um ensaio CUT&Tag se assemelha essencialmente ao processo de experimentos ICC e IF, mas ocorre apenas em um tubo de ensaio. O CUT&Tag não precisa de cromatina fragmentada para começar e, em vez disso, o genoma deve estar intacto para a ligação do anticorpo1. No primeiro dia de um experimento ChIP, os pesquisadores normalmente gastam até 4 h preparando as cromatinas fragmentadas dos núcleos com sonicação ou digestão de MNase antes que os pedaços curtos de cromatina possam ser misturados com grânulos de anticorpos 4,5. Em contraste notável, a carga de trabalho do primeiro dia de um procedimento CUT & Tag é apenas imobilizar as células para os grânulos de concanavalina A e, em seguida, adicionar o anticorpo primário aos grânulos celulares. Isso requer apenas ~ 40 min1.

Vale ressaltar que o Clivage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN) é uma alternativa importante ao CUT&Tag. O CUT&RUN foi estabelecido com base em um mecanismo de trabalho semelhante ao CUT&Tag. No CUT&Tag, os anticorpos guiam a transposase pA/G-Tn5 para todos os locais onde a enzima cortará um pedaço de cromatina e, enquanto isso, o marcará com adaptadores de criação de bibliotecas, enquanto no CUT&RUN, o papel de pA/G-Tn5 é desempenhado pela pA/G-MNase, que executa apenas a parte de corte do trabalho6. Portanto, em comparação com o CUT&Tag, o CUT&RUN requer uma etapa adicional que é colar os adaptadores de criação de bibliotecas nas peças de DNA fragmentadas por pA/G-MNase 7,8. Devido às altas semelhanças entre o CUT&Tag e o CUT&RUN, os pesquisadores familiarizados com o CUT&Tag se adaptarão facilmente para realizar o CUT&RUN com proficiência. No entanto, deve-se notar que existem algumas pequenas diferenças entre o CUT&Tag e o CUT&RUN. Os protocolos CUT&RUN normalmente usam a concentração física de sal (~150 mM) nas etapas de lavagem, enquanto no CUT&Tag, o tampão de lavagem 300-Dig é rico em sal. Portanto, o CUT&Tag é bom para controlar o fundo ao traçar o perfil de marcas/variantes de histonas ou fatores de transcrição, pois essas proteínas se ligam direta e fortemente ao DNA1. A CUT&Tag pode ter problemas ao traçar o perfil de fatores associados à cromatina que não se ligam diretamente ao DNA e mostram fraca afinidade com a cromatina. Etapas de lavagem com alto teor de sal no CUT&Tag podem remover fatores associados à cromatina e não causar sinais na saída final. Embora existam casos bem-sucedidos em que o CUT&Tag pode ser usado para traçar o perfil dealgumas proteínas 9 não histonas/não fator de transcrição, ainda recomendamos o CUT&RUN em vez do CUT&Tag para traçar o perfil de proteínas associadas à cromatina fracamente ligadas.

Depois que os mamíferos atingem a idade adulta, seus tecidos musculares esqueléticos ainda contêm células-tronco musculares. Durante a lesão muscular, essas células-tronco podem ser ativadas e sofrer expansão e diferenciação do número de células para regenerar as fibras musculares danificadas10. Essas células-tronco são conhecidas como células-tronco / satélites musculares (MuSCs). Depois que os MuSCs são isolados de animais ou uma vez ativados por lesão muscular, eles começam a proliferar e se tornam mioblastos.

Para obter MuSCs da digestão do músculo esquelético de camundongos, marcadores de superfície MuSC como Vcam1 (Cd106), Cd34 e α7-integrina (Itga7) são frequentemente usados individualmente ou em combinações para enriquecer MuSCs durante a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) 11 . Foi demonstrado que Cd31/Cd45/Sca1/Vcam1+ é provavelmente a melhor combinação de marcadores para obter MuSCs >95% puros12. O FACS pode isolar MuSCs puros logo após a digestão dos músculos frescos. No entanto, se o projeto experimental não exigir MuSCs puros logo em seu isolamento, o pré-plaqueamento é mais econômico do que o FACS para obter mioblastos >90% puros (progênie MuSC).

MuSCs recém-isolados de camundongos não proliferam eficientemente em meio F10 de Ham suplementado com soro fetal bovino (FBS). Para expandir melhor o número de células de MuSCs e obter mioblastos suficientes, deve-se usar soro de crescimento bovino (BGS) em vez de FBS. No entanto, se o BGS não estiver disponível, o meio completo F10 de Ham (contendo cerca de 20% de FBS) pode ser misturado com um volume igual de meio condicional de células T para promover drasticamente a expansão do mioblasto13. Portanto, este protocolo também descreverá a preparação de meios MuSC condicionados por meio de células T.

Mais importante ainda, este protocolo fornece um exemplo completo da realização de ensaios H3K4me1 CUT&Tag em mioblastos de camundongos isolados de músculos dos membros posteriores de camundongos. Observe que este protocolo também se aplica a outros tipos de células e marcas de histonas e variantes de histonas, e os leitores só precisam otimizar o número de células ou quantidades de anticorpos para seus casos com base no enriquecimento das marcas ou variantes de histonas específicas que estudam.

Para ser usado no CUT&Tag ou CUT&RUN, o Tn5 ou MNase precisa ser fundido com a proteína A ou proteína G para produzir pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase ou pG-MNase. Aparentemente, tanto a proteína A quanto a proteína G podem ser fundidas nessas enzimas ao mesmo tempo para gerar pA/G-Tn5 ou pA/G-MNase. A proteína A e a proteína G apresentam afinidades diferenciais com IgGs de diferentes espécies. Portanto, a fusão da proteína A e da proteína G na enzima pode superar esse problema e tornar a enzima compatível com anticorpos de várias espécies.

Protocol

Os métodos apresentados neste manuscrito são todos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Laboratório de Guangzhou. Os camundongos usados para gerar os resultados representativos deste manuscrito foram alojados e mantidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Laboratório de Guangzhou. 1. Isolamento de mioblastos dos músculos dos membros posteriores do camundongo (Exemplo de uso de 1 camundongo)…

Representative Results

Antes de ligar as células aos grânulos de Concanavalina-A, verifique a suspensão celular ao microscópio. Assim, depois de incubar as células com contas de Concanavalina A, coloque os tubos de amostra no suporte magnético e o sobrenadante deve ser observado novamente usando um microscópio. Isso é para avaliar a eficiência com que as células foram capturadas pelas contas de Concanavalina-A. O tampão de lavagem contendo 7 x 105 células/mL deve se parecer com a Figura 1A a…

Discussion

O número específico de células necessário em uma determinada reação CUT&Tag depende completamente do enriquecimento das marcas/variantes de histonas ou proteínas de ligação à cromatina que devem ser testadas. Normalmente, para marcas de histonas muito enriquecidas, como H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac, etc., 25.000-50.000 mioblastos são suficientes para uma reação CUT&Tag. No entanto, algumas proteínas raras de ligação à cromatina podem exigir até 250.000 células. O número de células usado nos ensaios CUT…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Estratégica Prioritária da Academia Chinesa de Ciências (XDA16020400 a PH); a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32170804 para PH).

Materials

bFGF R&D Systems 233-FB-025
Collagen Corning 354236
Collagenase II Worthington LS004177
Concanavalin-A Sigma-Aldrich C5275
Concanavalin-A beads Bangs Laboratories BP531
Digitonin Sigma-Aldrich 300410
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
H3K4me1 antibody  abcam ab8895
Ham's F10 media Thermo Fisher Scientific 11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina  Vazyme TD903 This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes Qualityard QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes Anosun Magnetic CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix NEB M0541L For library-making PCR reaction
pA-Tn5 Vazyme S603-01 Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 5056489001
Proteinase K Beyotime ST535-100mg
RPMI-1640 media Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) Antibodies-online ABIN101961
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina  Vazyme TD202 This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers 
VAHTS DNA Clean Beads  Vazyme N411 Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size

References

  1. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).
  2. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLife. 4, e09225 (2015).
  3. Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
  4. Policastro, R. A., Zentner, G. E. Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites. Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).
  5. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  6. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, e21856 (2017).
  7. Mezger, A., et al. High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution. Nat Commun. 9, 3647 (2018).
  8. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8, 14049 (2017).
  9. Nakka, K., et al. JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment. Science. 377 (6606), 666-669 (2022).
  10. Fu, X., Wang, H., Hu, P. Stem cell activation in skeletal muscle regeneration. Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).
  11. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skelet Muscle. 6, 35 (2016).
  12. Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).
  13. Fu, X., et al. Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion. Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).
  14. Li, Y., et al. Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag. STAR Protoc. 2 (3), 100751 (2021).
  15. Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).
  16. Wardle, F. C. Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod. J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).
  17. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  18. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  19. Faralli, H., et al. UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration. J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).
  20. Yang, J. H., et al. Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).
  21. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).

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Cite This Article
Li, Y., Wu, X., Hu, P. Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) Assay in Mouse Myoblast Research. J. Vis. Exp. (205), e66066, doi:10.3791/66066 (2024).

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