Uso del ensayo de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag) en la investigación de mioblastos de ratón

El ensayo CUT&Tag se inventó para compensar algunos defectos evidentes de las ChIPs¹. Las dos principales desventajas de los ChIP son 1) el sesgo introducido al fragmentar la cromatina y 2) la incompetencia para trabajar con un número bajo de células. Los ensayos X-ChIP se basan en la sonicación o en la digestión de MNasa para obtener fragmentos de cromatina, mientras que los N-ChIP utilizan principalmente la digestión de MNasa para obtener nucleosomas. La sonicación muestra un sesgo hacia las ubicaciones relajadas de la cromatina, como las regiones promotoras², y aparentemente, la digestión de la MNasa también funciona de manera más eficiente en las fibras de cromatina relajadas. Además, algunos informaron que la digestión de MNasa también muestra un sesgo dependiente de la secuencia de ADN³. Por lo tanto, en la etapa de preparación de la entrada de los ensayos ChIP, es imposible obtener fragmentos de cromatina de todo tipo de ubicaciones genómicas de una manera perfectamente aleatoria. Además, los ensayos ChIP normalmente generan señales de fondo más altas en comparación con CUT&Tag y requieren más de 10 veces más lecturas que CUT&Tag para acentuar dónde están los picos ^1,4,5. Esto explica por qué los experimentos de ChIP tienen que comenzar con muchas más células que CUT&Tag. Esto no es un problema cuando se estudian líneas celulares, ya que se pueden pasar repetidamente para lograr un número de células muy alto. Sin embargo, el ensayo ChIP definitivamente no es una herramienta epigenética fuerte para estudiar poblaciones de células primarias raras o preciosas, aunque las células primarias obviamente tienen implicaciones más prácticas y médicas.

Si bien el largo y complicado procedimiento de ChIP desalienta a algunos investigadores a aprender o usar esta técnica, las personas se sienten más cómodas con ensayos más fáciles como la inmunocitoquímica (ICC) o la inmunofluorescencia (IF). Un ensayo CUT&Tag se asemeja esencialmente al proceso de los experimentos ICC e IF, pero solo tiene lugar en un tubo de ensayo. Para empezar, CUT&Tag no necesita cromatina fragmentada y, en cambio, el genoma debe estar intacto para la unión de^anticuerpos. En el primer día de un experimento ChIP, los investigadores normalmente pasan hasta 4 horas preparando las cromatinas fragmentadas de los núcleos con sonicación o digestión de MNasa antes de que los trozos cortos de cromatina puedan mezclarse con perlas de anticuerpos ^4,5. En notable contraste, la carga de trabajo del primer día de un procedimiento CUT&Tag consiste simplemente en inmovilizar las células a las perlas de concanavalina-A y luego agregar el anticuerpo primario a las perlas celulares. Esto solo requiere ~ 40 min¹.

Vale la pena mencionar que la escisión bajo objetivos y liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es una alternativa importante a CUT&Tag. CUT&RUN se estableció sobre la base de un mecanismo de trabajo similar al de CUT&Tag. En CUT&Tag, los anticuerpos guían la transposasa pA/G-Tn5 a todos los lugares donde la enzima cortará cada uno un trozo de cromatina y, mientras tanto, lo marcará con adaptadores de creación de bibliotecas, mientras que en CUT&RUN, el papel de pA/G-Tn5 lo desempeña la pA/G-MNasa que solo realiza la parte de corte del trabajo⁶. Por lo tanto, en comparación con CUT&Tag, CUT&RUN requiere un paso adicional que consiste en pegar los adaptadores de creación de bibliotecas en las piezas de ADN fragmentadas por pA/G-MNasa ^7,8. Debido a las grandes similitudes entre CUT&Tag y CUT&RUN, los investigadores familiarizados con CUT&Tag se adaptarán fácilmente a la ejecución competente de CUT&RUN. Sin embargo, hay que tener en cuenta que existen algunas pequeñas diferencias entre CUT&Tag y CUT&RUN. Los protocolos CUT&RUN normalmente utilizan la concentración física de sal (~150 mM) en las etapas de lavado, mientras que en CUT&Tag, el tampón de lavado 300-Dig tiene un alto contenido de sal. Por lo tanto, CUT&Tag es bueno para controlar el fondo al perfilar marcas/variantes de histonas o factores de transcripción, ya que estas proteínas se unen directa y fuertemente al ADN¹. CUT&Tag puede tener problemas al perfilar los factores asociados a la cromatina que no se unen directamente al ADN y muestran una afinidad débil con la cromatina. Los pasos de lavado con alto contenido de sal en CUT&Tag pueden eliminar los factores asociados a la cromatina y no causar señales en el resultado final. Aunque hay casos exitosos en los que CUT&Tag se puede utilizar para perfilar algunas proteínas no histonas / factores de transcripción⁹, todavía recomendamos CUT&RUN en lugar de CUT&Tag para perfilar proteínas asociadas a cromatina débilmente unidas.

Después de que los mamíferos alcanzan la edad adulta, sus tejidos musculares esqueléticos todavía contienen células madre musculares. Durante la lesión muscular, estas células madre pueden activarse y experimentar una expansión y diferenciación del número de células para regenerar^{las fibras} musculares dañadas. Estas células madre se conocen como células madre musculares/satélite (MuSC). Después de que las MuSC se aíslan de los animales o una vez activadas por una lesión muscular, comienzan a proliferar y se convierten en mioblastos.

Para obtener MuSCs a partir de la digestión del músculo esquelético de ratón, los marcadores de superficie MuSC como Vcam1 (Cd106), Cd34 y α7-integrina (Itga7) se utilizan a menudo individualmente o en combinaciones para enriquecer MuSCs durante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)¹¹. Se ha demostrado que Cd31^–/Cd45^–/Sca1^–/Vcam1⁺ es probablemente la mejor combinación de marcadores para obtener MuSCs¹² con una pureza del >95%. El FACS puede aislar las MuSC puras justo después de digerir los músculos frescos. Sin embargo, si el diseño experimental no requiere MuSCs puros en su aislamiento, el pre-siembra es más rentable que el FACS para obtener mioblastos >90% puros (progenie de MuSC).

Las MuSC recién aisladas de ratones no proliferan de manera eficiente en el medio F10 de Ham suplementado con suero fetal bovino (FBS). Para expandir mejor el número de células de MuSC y obtener suficientes mioblastos, se debe usar suero de crecimiento bovino (BGS) en lugar de FBS. Sin embargo, si BGS no está disponible, el medio completo F10 de Ham (que contiene aproximadamente un 20% de FBS) se puede mezclar con un volumen igual de medio condicional de células T para promover drásticamente la expansión del mioblasto¹³. Por lo tanto, este protocolo también describirá la preparación de medios MuSC condicionados por medios de células T.

Y lo que es más importante, este protocolo proporciona un ejemplo completo de la realización de ensayos CUT&Tag H3K4me1 en mioblastos de ratón aislados de los músculos de las extremidades posteriores de ratón. Tenga en cuenta que este protocolo también se aplica a otros tipos de células y marcas de histonas y variantes de histonas, y los lectores solo necesitan optimizar el número de células o las cantidades de anticuerpos para sus casos en función del enriquecimiento de las marcas o variantes de histonas específicas que estudian.

Para poder ser utilizada en CUT&Tag o CUT&RUN, la Tn5 o MNasa debe fusionarse con la proteína A o la proteína G para producir pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNasa o pG-MNasa. Aparentemente, tanto la proteína A como la proteína G pueden fusionarse con estas enzimas al mismo tiempo para generar pA/G-Tn5 o pA/G-MNasa. La proteína A y la proteína G muestran afinidades diferenciales con las IgG de diferentes especies. Por lo tanto, la fusión de la proteína A y la proteína G juntas en la enzima puede superar este problema y hacer que la enzima sea compatible con anticuerpos de múltiples especies.