Summary

Uso del ensayo de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag) en la investigación de mioblastos de ratón

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Los investigadores nuevos en el campo de la epigenética encontrarán en CUT&Tag una alternativa significativamente más fácil que los ensayos ChIP. CUT&Tag ha beneficiado enormemente a los estudios epigenéticos en poblaciones de células raras y primarias, generando datos de alta calidad a partir de muy pocas células. Este protocolo describe la realización de ensayos H3K4me1 CUT&Tag en mioblastos de ratón aislados de músculos de las extremidades posteriores de ratón.

Abstract

Este documento de protocolo tiene como objetivo proporcionar a los nuevos investigadores todos los detalles sobre el uso de Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) para perfilar las ubicaciones genómicas de los factores de unión a la cromatina, las marcas de histonas y las variantes de histonas. Los protocolos CUT&Tag funcionan muy bien con mioblastos de ratón y células madre musculares (MuSC) recién aisladas. Se pueden aplicar fácilmente a muchos otros tipos de células, siempre y cuando las células puedan ser inmovilizadas por perlas de concanavalina-A. En comparación con CUT&Tag, los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) son experimentos que requieren mucho tiempo. Los ensayos ChIP requieren el tratamiento previo de la cromatina antes de que el material cromático pueda utilizarse para la inmunoprecipitación. En la reticulación de la ChIP (X-ChIP), el pretratamiento de la cromatina implica la reticulación y la sonicación para fragmentar la cromatina. En el caso de la ChIP nativa (N-ChIP), las cromatinas fragmentadas se logran normalmente por digestión de nucleasa microcócica (MNasa). Tanto la sonicación como la digestión con MNasa introducen cierto sesgo en los experimentos de ChIP. Los ensayos CUT&Tag se pueden completar en menos pasos y requieren muchas menos células en comparación con los ChIP, pero proporcionan información más imparcial sobre los factores de transcripción o las marcas de histonas en varias ubicaciones genómicas. CUT&Tag puede funcionar con tan solo 5.000 celdas. Debido a su mayor sensibilidad y menor señal de fondo que los ChIPs, los investigadores pueden esperar obtener datos de picos confiables a partir de solo varios millones de lecturas después de la secuenciación.

Introduction

El ensayo CUT&Tag se inventó para compensar algunos defectos evidentes de las ChIPs1. Las dos principales desventajas de los ChIP son 1) el sesgo introducido al fragmentar la cromatina y 2) la incompetencia para trabajar con un número bajo de células. Los ensayos X-ChIP se basan en la sonicación o en la digestión de MNasa para obtener fragmentos de cromatina, mientras que los N-ChIP utilizan principalmente la digestión de MNasa para obtener nucleosomas. La sonicación muestra un sesgo hacia las ubicaciones relajadas de la cromatina, como las regiones promotoras2, y aparentemente, la digestión de la MNasa también funciona de manera más eficiente en las fibras de cromatina relajadas. Además, algunos informaron que la digestión de MNasa también muestra un sesgo dependiente de la secuencia de ADN3. Por lo tanto, en la etapa de preparación de la entrada de los ensayos ChIP, es imposible obtener fragmentos de cromatina de todo tipo de ubicaciones genómicas de una manera perfectamente aleatoria. Además, los ensayos ChIP normalmente generan señales de fondo más altas en comparación con CUT&Tag y requieren más de 10 veces más lecturas que CUT&Tag para acentuar dónde están los picos 1,4,5. Esto explica por qué los experimentos de ChIP tienen que comenzar con muchas más células que CUT&Tag. Esto no es un problema cuando se estudian líneas celulares, ya que se pueden pasar repetidamente para lograr un número de células muy alto. Sin embargo, el ensayo ChIP definitivamente no es una herramienta epigenética fuerte para estudiar poblaciones de células primarias raras o preciosas, aunque las células primarias obviamente tienen implicaciones más prácticas y médicas.

Si bien el largo y complicado procedimiento de ChIP desalienta a algunos investigadores a aprender o usar esta técnica, las personas se sienten más cómodas con ensayos más fáciles como la inmunocitoquímica (ICC) o la inmunofluorescencia (IF). Un ensayo CUT&Tag se asemeja esencialmente al proceso de los experimentos ICC e IF, pero solo tiene lugar en un tubo de ensayo. Para empezar, CUT&Tag no necesita cromatina fragmentada y, en cambio, el genoma debe estar intacto para la unión deanticuerpos. En el primer día de un experimento ChIP, los investigadores normalmente pasan hasta 4 horas preparando las cromatinas fragmentadas de los núcleos con sonicación o digestión de MNasa antes de que los trozos cortos de cromatina puedan mezclarse con perlas de anticuerpos 4,5. En notable contraste, la carga de trabajo del primer día de un procedimiento CUT&Tag consiste simplemente en inmovilizar las células a las perlas de concanavalina-A y luego agregar el anticuerpo primario a las perlas celulares. Esto solo requiere ~ 40 min1.

Vale la pena mencionar que la escisión bajo objetivos y liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es una alternativa importante a CUT&Tag. CUT&RUN se estableció sobre la base de un mecanismo de trabajo similar al de CUT&Tag. En CUT&Tag, los anticuerpos guían la transposasa pA/G-Tn5 a todos los lugares donde la enzima cortará cada uno un trozo de cromatina y, mientras tanto, lo marcará con adaptadores de creación de bibliotecas, mientras que en CUT&RUN, el papel de pA/G-Tn5 lo desempeña la pA/G-MNasa que solo realiza la parte de corte del trabajo6. Por lo tanto, en comparación con CUT&Tag, CUT&RUN requiere un paso adicional que consiste en pegar los adaptadores de creación de bibliotecas en las piezas de ADN fragmentadas por pA/G-MNasa 7,8. Debido a las grandes similitudes entre CUT&Tag y CUT&RUN, los investigadores familiarizados con CUT&Tag se adaptarán fácilmente a la ejecución competente de CUT&RUN. Sin embargo, hay que tener en cuenta que existen algunas pequeñas diferencias entre CUT&Tag y CUT&RUN. Los protocolos CUT&RUN normalmente utilizan la concentración física de sal (~150 mM) en las etapas de lavado, mientras que en CUT&Tag, el tampón de lavado 300-Dig tiene un alto contenido de sal. Por lo tanto, CUT&Tag es bueno para controlar el fondo al perfilar marcas/variantes de histonas o factores de transcripción, ya que estas proteínas se unen directa y fuertemente al ADN1. CUT&Tag puede tener problemas al perfilar los factores asociados a la cromatina que no se unen directamente al ADN y muestran una afinidad débil con la cromatina. Los pasos de lavado con alto contenido de sal en CUT&Tag pueden eliminar los factores asociados a la cromatina y no causar señales en el resultado final. Aunque hay casos exitosos en los que CUT&Tag se puede utilizar para perfilar algunas proteínas no histonas / factores de transcripción9, todavía recomendamos CUT&RUN en lugar de CUT&Tag para perfilar proteínas asociadas a cromatina débilmente unidas.

Después de que los mamíferos alcanzan la edad adulta, sus tejidos musculares esqueléticos todavía contienen células madre musculares. Durante la lesión muscular, estas células madre pueden activarse y experimentar una expansión y diferenciación del número de células para regenerarlas fibras musculares dañadas. Estas células madre se conocen como células madre musculares/satélite (MuSC). Después de que las MuSC se aíslan de los animales o una vez activadas por una lesión muscular, comienzan a proliferar y se convierten en mioblastos.

Para obtener MuSCs a partir de la digestión del músculo esquelético de ratón, los marcadores de superficie MuSC como Vcam1 (Cd106), Cd34 y α7-integrina (Itga7) se utilizan a menudo individualmente o en combinaciones para enriquecer MuSCs durante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)11. Se ha demostrado que Cd31/Cd45/Sca1/Vcam1+ es probablemente la mejor combinación de marcadores para obtener MuSCs12 con una pureza del >95%. El FACS puede aislar las MuSC puras justo después de digerir los músculos frescos. Sin embargo, si el diseño experimental no requiere MuSCs puros en su aislamiento, el pre-siembra es más rentable que el FACS para obtener mioblastos >90% puros (progenie de MuSC).

Las MuSC recién aisladas de ratones no proliferan de manera eficiente en el medio F10 de Ham suplementado con suero fetal bovino (FBS). Para expandir mejor el número de células de MuSC y obtener suficientes mioblastos, se debe usar suero de crecimiento bovino (BGS) en lugar de FBS. Sin embargo, si BGS no está disponible, el medio completo F10 de Ham (que contiene aproximadamente un 20% de FBS) se puede mezclar con un volumen igual de medio condicional de células T para promover drásticamente la expansión del mioblasto13. Por lo tanto, este protocolo también describirá la preparación de medios MuSC condicionados por medios de células T.

Y lo que es más importante, este protocolo proporciona un ejemplo completo de la realización de ensayos CUT&Tag H3K4me1 en mioblastos de ratón aislados de los músculos de las extremidades posteriores de ratón. Tenga en cuenta que este protocolo también se aplica a otros tipos de células y marcas de histonas y variantes de histonas, y los lectores solo necesitan optimizar el número de células o las cantidades de anticuerpos para sus casos en función del enriquecimiento de las marcas o variantes de histonas específicas que estudian.

Para poder ser utilizada en CUT&Tag o CUT&RUN, la Tn5 o MNasa debe fusionarse con la proteína A o la proteína G para producir pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNasa o pG-MNasa. Aparentemente, tanto la proteína A como la proteína G pueden fusionarse con estas enzimas al mismo tiempo para generar pA/G-Tn5 o pA/G-MNasa. La proteína A y la proteína G muestran afinidades diferenciales con las IgG de diferentes especies. Por lo tanto, la fusión de la proteína A y la proteína G juntas en la enzima puede superar este problema y hacer que la enzima sea compatible con anticuerpos de múltiples especies.

Protocol

Los métodos presentados en este manuscrito están todos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio de Guangzhou. Los ratones utilizados para generar los resultados representativos de este manuscrito se alojaron y mantuvieron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio de Guangzhou. 1. Aislamiento de mioblastos de los músculos de las extremidades traseras del ratón (Ejemplo de uso de 1 ratón) Diluir el ácido acético glacial con ddH2O a 0,02 M y esterilizarlo en autoclave. Diluir colágeno (de cola de rata) a 0,1 mg/mL con ácido acético 0,02 M. Agregue esta solución de colágeno a las placas de cultivo para cubrir el fondo de la placa en una incubadora celular a 37 °C durante toda la noche. Antes de usar, retire la solución de colágeno y lave el plato dos veces con 1x PBS. La solución de colágeno se puede reutilizar de 8 a 10 veces. Sacrifica un ratón de 8 a 12 semanas. (Los ratones viejos tienen bajos rendimientos de MuSC y mioblastos). Aísle y coloque todos los músculos de las extremidades traseras del ratón en un plato de 10 cm. Use 1x PBS (con penicilina/estreptomicina) para enjuagar los músculos 4 veces. Después de cada enjuague, siempre transfiera los músculos a un nuevo plato. Después del enjuague final, retire el PBS y pique los músculos con unas tijeras. Agregue 6 mL de 1x PBS que contenga dispasa II (1.1 U/mL) y colagenasa II (830 U/mL) para digerir los músculos picados, y la digestión debería durar ~ 1.5 h. Para realizar la digestión, transfiera los músculos picados a un tubo en un baño de agua a 37 °C o deje directamente los músculos picados dentro del plato y colóquelo en una incubadora de células de CO2 a 37 °C. Si usa una incubadora de células para digerir, agite el plato cada 15-30 minutos para mezclar bien la digestión.NOTA: La dispasa II debe elaborarse primero como caldo de 11 U/mL con medio DMEM (sin suero), y la colagenasa II debe elaborarse como caldo de 10.000 U/mL con 1x PBS. Cuando se complete la digestión, use una pipeta de plástico de 10 ml para enjuagar los tejidos digeridos hacia arriba y hacia abajo varias veces para homogeneizar completamente la mezcla de digestión. Añadir 10 mL de medio de crecimiento MuSC/Myoblast para ralentizar la digestión. Los detalles sobre la preparación de los medios de crecimiento MuSC/Myoblast se pueden encontrar en la Sección 2. Pasa la mezcla por un colador de 70 μm. Use 1x PBS para enjuagar la placa de digestión y pase este PBS a través del colador también, para recoger todas las células en la placa de digestión. Centrifugar a 350 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante al vacío. Vuelva a suspender el pellet de celda con 20 mL de 1x PBS y pase las células a través de un colador de 40 μm. Centrifugar a 350 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante al vacío. Utilice 20 mL de medio de crecimiento MuSC/Myoblast para resuspender las células y sembrar las células en una placa de plástico normal de 10 cm. Los MuSC no pueden adherirse a la parte inferior de la placa durante este tiempo y permanecerán flotando principalmente en el medio.NOTA: Este es el primer pre-enchapado en placas de plástico. Después de 1,5 h, agite brevemente la placa y transfiera el líquido a dos platos de 10 cm recubiertos de colágeno, cada plato contiene 10 ml de cultivo. Ahora, los MuSC se adherirán y crecerán en las placas recubiertas de colágeno. Cambie el medio después de 2 días. Las placas recubiertas de colágeno se preparan como en los pasos 1-4 de esta sección. Después de otro día, pase las células: Retire el medio, lave las células una vez con 1x PBS y tripsinícelas las células. Utilice el medio de crecimiento MuSC/Myoblast para eliminar las células de las placas, muévalas a una nueva placa de plástico e incube en la incubadora de células durante 40 minutos.NOTA: Este es el segundo pre-chapado en placas de plástico. Vierta el cultivo en una nueva placa de plástico e incube en la incubadora de células durante otros 20 minutos.NOTA: Este es el tercer pre-enchapado en placas de plástico. A continuación, divida el sobrenadante de la placa en 8 placas de 10 cm recubiertas de colágeno para subcultivar las células. La proporción de pasajes aquí es 2: 8 (1: 4). Después de tres veces de pre-siembra descrita anteriormente, los mioblastos pueden alcanzar más del 90% de pureza. Por lo tanto, después de este punto, no es necesario pre-platear cuando se siguen pasando los mioblastos. 2. Preparación de medios de crecimiento MuSC/Myoblast (Ejemplo de preparación a partir de 5 ratones) Sacrifique 5 ratones jóvenes y sanos de tipo salvaje, aísle el bazo y enjuague el bazo una vez con 1x PBS (con penicilina/estreptomicina). Use tijeras para eliminar las partes oscuras o las manchas en el bazo, si las hay. Deseche el bazo si la mayor parte se ha vuelto negro. Coloque los 5 bazos en un colador de 40 μm en la parte superior de un tubo de 50 ml. Abra un paquete de jeringa estéril de 1 ml, extraiga el émbolo y deseche el cilindro. En el colador de 40 μm, sostenga el tapón de goma y use el resto del pulgar del émbolo para triturar y disociar los tejidos del bazo en células individuales. Tenga cuidado de no tocar y contaminar el pulgar del émbolo al abrir el paquete de la jeringa. Mientras muele el bazo, ocasionalmente use 1x PBS para lavar las células disociadas del bazo en el tubo de 50 ml debajo del colador. Después de que todas las células del bazo se hayan enjuagado en el tubo de 50 ml a través del colador, centrifugue el tubo a 500 x g durante 10 minutos. Utilice 1 ml de 1x tampón de lisis de glóbulos rojos para resuspender el pellet. Lise los glóbulos rojos durante ~ 1 min.NOTA: El tampón de lisis de glóbulos rojos 10x contiene 155 mM de NH4Cl, 10 mM de NaHCO3 y 1 mM de sal disódica EDTA en ddH2O. Filtre para esterilizar y no lo haga en autoclave. Diluir con ddH2O a 1x antes de usar. Llene el tubo de 50 ml con 1x PBS para detener el proceso de lisis de los glóbulos rojos. Vuelva a colar la suspensión celular con un colador de 40 μm y luego centrifugue a 500 x g durante 10 min. Vuelva a suspender las células con 2 mL de medio completo RPMI-1640 (medio RPMI-1640 con 10% de FBS y penicilina/estreptomicina) con un pipeteo muy suave. Agregue más medios completos RPMI-1640 en el tubo y mezcle bien. Distribuya la suspensión celular en diez matraces de cultivo T75. El volumen final de cultivo en cada matraz de cultivo T75 debe ser de 20 mL. Añadir 10 μL de caldo de Concanavalina-A en cada matraz de cultivo T75 y mezclar bien. La concanavalina-A activa la proliferación de las células T.NOTA: El stock de concanavalina-A es de 4 mg/mL y se prepara disolviendo concanavalin-A en 1x PBS. Aquí se utiliza la propia concanavalina-A, y no hay que confundirla con las perlas de concanavalina-A utilizadas posteriormente en los ensayos CUT&TAG. Después de 48 h, complemente cada matraz T75 con otros 20 mL de medio completo RPMI-1640 para que el volumen total sume 40 mL. Otras 24 h más tarde, recoja todo el cultivo en cada matraz T75 y centrifugue a 600 x g durante 3 min. El sobrenadante es un medio condicional de células T y puede almacenarse entre -20 °C y -80 °C durante un máximo de 2 meses. Deseche los gránulos de células del bazo. Antes de usar, descongele el medio condicional de células T y esterilice aún más el medio con un filtro de 0,22 μm. Para hacer el medio F10 de Ham, agregue 100 mL de FBS, 300 μL de caldo de bFGF y 6 mL de penicilina/estreptomicina en 500 mL de medio F10 de Ham.NOTA: el stock de bFGF es de 5 μg/mL y se prepara disolviendo bFGF en el medio F10 de Ham. Mezcle el medio completo F10 del Ham con el medio condicional de células T filtradas descrito anteriormente en una proporción de 1:1 para crear el medio de crecimiento MuSC/Myobblast. 3. CUT&Tag con mioblastos (Ejemplo de 3 reacciones CUT&Tag) Preparación de reactivos clavePurifique la transposasa pA/G-Tn5 internamente a partir de cultivo bacteriano utilizando el método publicado14. Esta enzima solo alcanza su forma funcional hasta que se monta con adaptadores de ADN que crean bibliotecas. Lo más importante es que pA/G-Tn5 está disponible comercialmente en muchas fuentes. Los oligonucleótidos para hacer adaptadores se muestran en la Tabla 1. En concreto, recocer Oligo-Rev con Oligo-A y Oligo-B, respectivamente, para hacer Adaptor-A y Adaptor-B de doble cadena en consecuencia. Los detalles del recocido para hacer los adaptadores se pueden encontrar en otro lugar14. Incubar el adaptador-A y el adaptador-B con transposasa pA/G-Tn5 a temperatura ambiente (RT) durante 2 h. Entonces, esta transposasa tomará su forma funcional. En las siguientes secciones de este manuscrito, la forma funcional de pA/G-Tn5 se denominará pA/G-Tn5a.NOTA: Si el pA/G-Tn5 se compra en lugar de fabricarse internamente, asegúrese de aclarar si el artículo comprado es pA/G-Tn5 montado con adaptadores (en otras palabras, listo para usar) o si es solo la enzima pA/G-Tn5 en sí. Si se trata solo de la enzima, prepare los dos adaptadores descritos anteriormente y móntelos en el pA/G-Tn5 antes de utilizar finalmente esta enzima para CUT&Tag. Para las recetas del tampón de encuadernación, el tampón de lavado, el tampón de lavado, el tampón de 300-Dig y el tampón de etiquetado, los lectores también pueden consultar Kaya-Okur et al.1. Prepare el tampón de unión, que contiene 20 mM de HEPES pH 7,5, 10 mM de KCl, 1 mM de CaCl2 y 1 mM de MnCl2. Prepare el tampón de lavado, que contiene 20 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,5 mM de espermidina y 1x cóctel de inhibidores de proteasa. Prepare la digitonina como un caldo concentrado en DMSO y luego prepare el tampón de lavado agregando digitonina en el tampón de lavado a una concentración de 0,5 mg / mL. Prepare el tampón de anticuerpos añadiendo EDTA a una concentración de 2 mM y BSA a una concentración del 0,1%, en el tampón Dig-wash. Prepare tampón 300-Dig que contiene 20 mM de HEPES pH 7,5, 300 mM de NaCl, 0,5 mM de espermidina, 1x cóctel de inhibidores de la proteasa y 0,1-0,5 mg/mL de digitonina. Prepare el tampón de etiquetado complementando el tampón 300-Dig con 10 mM MgCl2. MgCl2 puede activar la actividad enzimática de pA/G-Tn5a.NOTA: La información de otros materiales se proporciona en el archivo de la Tabla de Materiales . Activación del cordón de concanavalina-AMezcle 30 μL de perlas de concanavalina-A (10 μL para cada reacción) en 300 μL de tampón de unión en un tubo de centrífuga de 1,5 mL. Invierta varias veces para mezclar bien. Coloque el tubo en una rejilla magnética. Después de que el líquido esté claro, retire el sobrenadante. Retire el tubo de la rejilla magnética, agregue 300 μL de tampón de unión en el tubo, mezcle bien y divida uniformemente en 3 tubos de una tira de tubo de 8 PCR. Designe cada tubo con una reacción CUT&Tag. Coloque la tira de tubo de 8-PCR en una rejilla magnética y espere hasta que el líquido esté claro. Aspire el sobrenadante y retire los tubos de la rejilla magnética. Agregue 10 μL de tampón aglutinante en cada tubo y mezcle bien. Coloque las perlas preparadas en hielo o a 4 °C hasta que las celdas estén listas para continuar. Unión de células en perlas de concanavalina-ATripsinizar mioblastos de ratón cultivados de las placas, lavar las células una vez con RT 1x PBS y, finalmente, resuspender las células en el tampón de lavado en RT. Evite la tripsinización excesiva, ya que esto puede comprometer la afinidad de la membrana celular con las perlas de concanavalina-A. Ajuste la densidad celular a alrededor de 7 x 105 células/mL en el tampón de lavado, de modo que 100 μL de suspensión celular contengan aproximadamente 70.000 células, suficientes para una reacción CUT&Tag. Pipetear 100 μL de la suspensión celular en cada tubo de la tira de tubo de 8-PCR, que ya contiene 10 μL de perlas de Concanavalin-A preparadas. Mezclar bien e incubar en un agitador de “movimiento de balancín” durante 10 minutos a RT. Coloque la tira de tubo de 8-PCR en una rejilla magnética. Espere hasta que se aclare y retire el sobrenadante. Para evaluar si las perlas de concanavalina-A han secuestrado eficientemente las células, revise el sobrenadante bajo un microscopio para ver cuántas células quedan en el sobrenadante. Después de la etapa de unión de la perla de concanavalina-A, se deben observar muy pocas o ninguna célula en el sobrenadante. Incubación de las células con un anticuerpo primarioPara cada muestra, diluya 1 μL de anticuerpo H3K4me1 en 50 μL de tampón de anticuerpos y agregue el anticuerpo diluido en cada tubo de muestra. Mezcle bien las perlas con el anticuerpo diluido invirtiendo los tubos varias veces. Coloque las muestras en el agitador de “movimiento de balancín” para incubar a 4 °C durante toda la noche.NOTA: Como mencionó el Dr. Steven Henikoff1, no fue necesario utilizar un control negativo de IgG en todos los ensayos CUT&Tag. En comparación con los ChIP, los ensayos CUT&Tag vienen con una señal de fondo mucho más baja o nula. Por lo tanto, el uso de IgG para realizar un ensayo CUT&Tag de “control negativo” no aporta ninguna información útil. Por el contrario, el uso de un anticuerpo validado por CUT&Tag para realizar un control positivo es importante para evaluar si el ensayo CUT&Tag ha funcionado. Incubación de las células con un anticuerpo secundarioAl día siguiente por la mañana, coloque las muestras en el estante magnético y espere hasta que las muestras se aclaren. Retire el sobrenadante, que es el anticuerpo primario. No es necesario lavar las cuentas; Añadir directamente 50 μL de anticuerpo secundario diluido (1:100) en cada tubo de muestra.NOTA: El anticuerpo secundario se diluye con tampón Dig-wash en una proporción de 1:100. Para permitir un reconocimiento más eficiente de pA/G-Tn5a, los anticuerpos secundarios no deben conjugarse con ninguna molécula o grupo como HRP, biotina o fluoróforos. Mezclar bien e incubar en el agitador “balancín” a RT durante 1 h. Vuelva a colocar las muestras en la rejilla magnética, espere hasta que las muestras se aclaren y deseche el sobrenadante. Agregue 200 μL de tampón Dig-wash en cada tubo e invierta varias veces para lavar el exceso de anticuerpos. Vuelva a colocarlo en la rejilla magnética, espere hasta que se aclare y retire el sobrenadante. Repita este lavado dos veces más para eliminar por completo el exceso de anticuerpos no unidos. Incubación de las células con pA/G-Tn5aDespués del último lavado, coloque las muestras en la rejilla magnética, espere hasta que las muestras se aclaren y retire todo el líquido del tubo. Para cada tubo de muestra, agregue 100 μL de tampón 300-Dig que contenga pA/G-Tn5a a 0,04 μM. Mezcle bien e incube en el agitador de movimiento de balancín durante 1 h a RT. Colóquelo en el estante magnético. Espere hasta que las muestras se aclaren y retire el sobrenadante. Agregue 200 μL de tampón 300-Dig en cada muestra, mezcle bien y colóquelo en el agitador para lavar la muestra durante 3 minutos a RT. Colóquelo en el estante magnético. Espere hasta que las muestras se aclaren y retire el sobrenadante. Repita este lavado dos veces más para eliminar el exceso de pA/G-Tn5a y bajar el fondo. Escisión y etiquetado de los genomasDespués del último lavado, coloque las muestras en la rejilla magnética y pipetee completamente el líquido del tubo. Para cada muestra, añadir 50 μL de tampón de etiquetado. Mezclar bien e incubar en una máquina de PCR a 37 °C durante 1 h. No utilice la función de calentamiento de la tapa de la máquina de PCR.NOTA: Opcionalmente, debido al desgaste del material durante el siguiente paso de purificación del ADN genómico, se pueden agregar algunos ADN con picos en el búfer de etiquetado para que los picos se muestren en los resultados finales de la secuenciación y se puedan usar para normalizar los datos. El método para preparar y utilizar el ADN en espiga se puede encontrar en otro lugar14. Purificación total del ADN genómicoDespués del etiquetado, agregue otros 150 μL de tampón de etiquetado para cada muestra. El volumen total es ahora de 200 μL. A continuación, para cada muestra, añadir 10 μL de EDTA 0,5 M, 3 μL de SDS al 10% y 2,5 μL de 20 mg/mL de proteinasa K. Vortex para mezclar bien e incubar a 55 °C durante 2 h. Pipetear cada muestra en 200 μL de fenol/cloroformo en un tubo de centrífuga de 1,5 mL y vórtice durante 10 s. Centrifugar a 18.000 x g durante 5 min. Transfiera la capa superior a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml. Añadir 200 μL de cloroformo en cada tubo y vórtice durante 10 s. Centrifugar a 18.000 x g durante 5 min. Aspire la capa superior en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml. Luego, para cada muestra, agregue 550 μL de etanol al 100% para precipitar el ADN a -80 °C durante 1 h. Para visualizar mejor el pellet de ADN, agregue 1 μL de 20 mg/mL de glucógeno. Centrífuga a velocidad máxima (>18.000 x g) durante 15 min para granular el ADN. Vierta con cuidado el sobrenadante, lave la pastilla de glucógeno/ADN con etanol al 75% una vez y vuelva a centrifugar a velocidad máxima durante 5 minutos. Retire el etanol al 75% y vuelva a suspender el pellet de glucógeno/ADN con 21 μL de ddH2O. Preparación y secuenciación de bibliotecasConfigure la PCR que prepara la biblioteca. Para indexar las muestras que se van a secuenciar juntas, utilice un cebador N7XX Illumina diferente para cada muestra y un cebador universal N5XX Illumina. Si se indexan más de 12 muestras, también se requerirán diferentes cebadores N5XX Illumina. Illumina proporciona doce cebadores N7XX y ocho cebadores N5XX, por lo que el número total de combinaciones de N7XX con N5XX es 12 x 8 = 96. La configuración de la reacción de PCR se muestra en la Tabla 2. Determine aproximadamente el número de ciclo de PCR en la PCR de preparación para bibliotecas mediante el número de células utilizado en el ensayo CUT&Tag. Normalmente, para un ensayo CUT&Tag con 50.000-100.000 células, 9-12 ciclos son suficientes, y los números de células entre 10.000-50.000 pueden requerir hasta 14 ciclos. El programa de PCR se muestra en la Tabla 3.NOTA: Para la mayoría de los ensayos CUT&Tag, si el anticuerpo ha funcionado correctamente, un número de ciclo de PCR entre 9 y 14 siempre debería generar una biblioteca útil para la secuenciación. Una buena biblioteca suele tener una concentración de 10-50 ng/μL (determinada por el ensayo Qubit) y de 20-30 μL de volumen. Por el contrario, si el anticuerpo no funcionó de manera eficiente y específica, entonces el simple aumento del número de ciclos no puede salvar los experimentos. Los números de ciclo excesivos no benefician en absoluto a los resultados y, en cambio, introducen más duplicados de PCR, lo que luego complicará el análisis de los datos. Utilice algunas cuentas de purificación de ADN/selección de tamaño disponibles en el mercado para purificar el ADN de la biblioteca y seleccionar el ADN de tamaños deseables. Diluya una pequeña alícuota de la biblioteca purificada con agua y utilícela para qPCR con cebadores específicos del locus para comprobar los enriquecimientos como en los experimentos de ChIP-qPCR. Antes de secuenciar la biblioteca, esto puede ayudar a determinar si CUT&Tag ha funcionado. Realice la secuenciación y el análisis de datos según las instrucciones del fabricante.NOTA: Los kits CUT&Tag están disponibles comercialmente en un puñado de empresas, y un ejemplo se puede encontrar en el archivo de la Tabla de Materiales .

Representative Results

Antes de unir las células a las perlas de concanavalina-A, verifique la suspensión celular bajo el microscopio. En consecuencia, después de incubar las células con perlas de concanavalina-A, coloque los tubos de muestra en el estante magnético y el sobrenadante debe observarse nuevamente con un microscopio. Esto es para evaluar la eficiencia con la que las células han sido capturadas por las perlas de Concanavalin-A. El tampón de lavado que contiene 7 x 105 células/mL debe verse como la <strong class="…

Discussion

El número de células específico requerido en una determinada reacción CUT&Tag depende completamente del enriquecimiento de las marcas/variantes de histonas o proteínas de unión a la cromatina que se van a analizar. Normalmente, para marcas de histonas muy enriquecidas como H3K4me1, H3K4me3 y H3K27ac, etcétera, 25.000-50.000 mioblastos son suficientes para una reacción CUT&Tag. Sin embargo, algunas proteínas raras de unión a la cromatina pueden requerir hasta 250.000 células. El número de células utilizado en…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Prioritaria Estratégica de la Academia China de Ciencias (XDA16020400 a PH); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32170804 a PH).

Materials

bFGF R&D Systems 233-FB-025
Collagen Corning 354236
Collagenase II Worthington LS004177
Concanavalin-A Sigma-Aldrich C5275
Concanavalin-A beads Bangs Laboratories BP531
Digitonin Sigma-Aldrich 300410
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
H3K4me1 antibody  abcam ab8895
Ham's F10 media Thermo Fisher Scientific 11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina  Vazyme TD903 This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes Qualityard QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes Anosun Magnetic CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix NEB M0541L For library-making PCR reaction
pA-Tn5 Vazyme S603-01 Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 5056489001
Proteinase K Beyotime ST535-100mg
RPMI-1640 media Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) Antibodies-online ABIN101961
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina  Vazyme TD202 This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers 
VAHTS DNA Clean Beads  Vazyme N411 Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size

Referencias

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Li, Y., Wu, X., Hu, P. Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) Assay in Mouse Myoblast Research. J. Vis. Exp. (205), e66066, doi:10.3791/66066 (2024).

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