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Detecção de polimorfismo de nucleotídeo único multigênico em câncer gástrico com base na plataforma de sequenciamento de semicondutores de íons

Published: May 10, 2024
doi:
10.3791/66058
, , , , , , , ,
1Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2Research and Development Department,Guangzhou Darui Biotechnology Co., Ltd, 3Key Laboratory of Antibody Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University, 4Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy,Southern Medical University

Summary

Este protocolo propõe procedimentos laboratoriais holísticos necessários para detectar polimorfismos de nucleotídeo único em amostras de câncer gástrico com base em uma plataforma de sequenciamento de semicondutores de íons. As sequências-alvo, adaptadores de ligação, amplificação e purificação de biblioteca e critérios de controle de qualidade também são descritos em detalhes.

Abstract

O câncer gástrico é um tumor heterogêneo comum. A maioria dos pacientes tem câncer gástrico avançado no momento do diagnóstico e muitas vezes precisa de quimioterapia. Embora o 5-fluorouracil (5-FU) seja amplamente utilizado para o tratamento, sua sensibilidade terapêutica e tolerância ao medicamento ainda precisam ser determinadas, o que enfatiza a importância da administração individualizada. A farmacogenética pode orientar a implementação clínica do tratamento individualizado. Os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), como marcador genético, contribuem para a seleção de regimes e dosagens quimioterápicas apropriadas. Alguns SNPs estão associados ao metabolismo do folato, o alvo terapêutico do 5-FU. Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) rs1801131 e rs1801133, diidrofolato redutase (DHFR) rs1650697 e rs442767, metionina sintase (MTR) rs1805087, gama-glutamil hidrolase (GGH) rs11545078 e família de portadores de soluto 19 membro 1 (SLC19A1) rs1051298 foram investigados em diferentes tipos de cânceres e drogas antitumorais antifolato, que têm potencial previsão e significado orientador para aplicação de 5-FU. A tecnologia de sequenciamento de semicondutores de próxima geração de torrente de íons pode detectar rapidamente SNPs relacionados ao câncer gástrico. Cada vez que uma base é estendida em uma cadeia de DNA, um H+ será liberado, causando mudanças locais no pH. O sensor iônico detecta mudanças de pH e converte sinais químicos em sinais digitais, obtendo sequenciamento por síntese. Esta técnica tem baixa necessidade de amostra, operação simples, baixo custo e velocidade de sequenciamento rápida, o que é benéfico para orientar a quimioterapia individualizada por SNPs.

Introduction

O câncer gástrico é um fardo pesado no campo da saúde pública global. De acordo com o Global Cancer Statistics 2020, publicado pela Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC), o câncer gástrico é o quinto câncer mais diagnosticado e a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer. Em todo o mundo, a incidência de taxa padronizada por idade no Leste Asiático é mais alta em homens e mulheres1. A ocorrência de câncer gástrico é insidiosa, o que significa que os pacientes geralmente não apresentam sintomas óbvios e específicos no estágio inicial. Entre todos os pacientes com câncer gástrico, em países sem rastreamento de rotina, 80% a 90% dos pacientes são diagnosticados em estágio avançado, quando o tumor não pode ser operado, ou recidivam dentro de 5 anos após a operação2.

Para o câncer gástrico avançado ou metastático, a quimioterapia é o principal tratamento, que pode melhorar a taxa de sobrevida e a qualidade de vida dos pacientes. Para a terapia inicial de pacientes com câncer gástrico metastático, um esquema de platina-fluoropirimidina é a principal escolha para um esquema quimioterápico de primeira linha3. A fluoropirimidina inclui principalmente 5-fluorouracil (5-FU) e derivados orais de fluoropirimidina, como capecitabina e tegafur. O principal alvo do 5-FU são as enzimas relacionadas ao metabolismo do folato, que inibem a síntese de DNA e retardam o crescimento do tecido tumoral. As reações adversas a medicamentos limitam sua utilidade, com diarreia, mucosite, mielossupressão e síndrome mão-pé entre os efeitos colaterais mais frequentes. Foi relatado que a resposta terapêutica e as reações adversas a medicamentos estão intimamente relacionadas a fatores na via metabólica do folato. Notavelmente, a mutação homozigótica de rs1801131 foi identificada como um indicador para a síndrome mão-pé (p = 4,1 x 10-6, OR = 9,99, IC 95%: 3,84-27,8)4. Embora as fluoropirimidinas sejam amplamente utilizadas na quimioterapia antineoplásica, sua quimiorresistência é uma emergência comum, causando falha terapêutica no tratamento do câncer gástrico. Por exemplo, a taxa de resposta geral é de apenas 10% a 15% entre pacientes com câncer colorretal avançado tratados com 5-FU apenas5. Além disso, as fluoropirimidinas têm toxicidade que não pode ser ignorada. As reações tóxicas induzidas pelo 5-FU incluem principalmente diarreia, síndrome mão-pé, estomatite, neutropenia, trombocitopenia, neurotoxicidade e até morte6. A toxicidade grave relacionada ao tratamento ocorre em 10% a 30% dos pacientes tratados com fluoropirimidinas, e a toxicidade fatal ocorre em 0,5% a 1% desses pacientes7.

Um estudo de qualidade de vida de pacientes com câncer gástrico avançado descobriu que a taxa de resposta foi inferior a 50% para aqueles que receberam quimioterapia baseada em 5-FU8. Portanto, entender os fatores relacionados à sensibilidade da quimioterapia baseada em 5-FU é particularmente importante para um tratamento preciso para maximizar a taxa de resposta e a eficácia, minimizando a toxicidade. Considerando que o 5-FU está intimamente relacionado ao metabolismo do folato, as variantes genéticas das enzimas na via metabólica do folato podem ser um dos fatores. Cerca de 90% da variação da sequência humana é atribuída a mutações de base única no DNA, conhecidas como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs)9. Quando os SNPs alteram as propriedades enzimáticas do metabolismo do folato, isso pode levar a diferenças individuais na eficácia, toxicidade e quimiorresistência ao fluorouracil em pacientes com câncer gástrico.

A metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) é usada principalmente para converter 5,10-metilenotetrahidrofolato (5,10-MTHF) em 5-metiltetrahidrofolato. O 5-FdUMP, um metabólito do 5-FU, forma ternário inativo com 5,10-MTHF e timidilato sintase (TS), inibindo a atividade do TS e levando à deficiência de dTMP10. O acúmulo de 5,10-MTHF pode aumentar o efeito de inibição do 5-FU no TS, que está correlacionado com a atividade do MTHFR. MTHFR rs1801131 e rs1801133 são os polimorfismos mais comuns, que estão relacionados à menor atividade enzimática (diminuição de 75% para rs1801133 e 30% para rs181131) e acúmulo de 5,10-MTHF11.

A diidrofolato redutase (DHFR) é a enzima chave no metabolismo do folato e na síntese de DNA. O DHFR reduz o diidrofolato, usando NADPH, a tetraidrofolato (THF), que é usado para transportar uma unidade de carbono. Os SNPs de DHFR podem afetar sua expressão, alterar a atividade e a abundância de THF e afetar ainda mais o metabolismo do folato e a sensibilidade do 5-FU. A mutação pontual DHFR rs1650697 ocorre no principal promotor do gene DHFR , o que aumenta a expressão de DHFR12. Um estudo descobriu que o rs442767 está associado à eficácia e toxicidade de medicamentos antitumorais antifolato, como pemetrexede e metotrexato. Em relação ao SNP rs442767, um genótipo GT significa a herança de um alelo G e um alelo T no mesmo locus nos cromossomos homólogos de cada pai. Da mesma forma, os genótipos GG e TT denotam a herança de dois alelos G ou dois alelos T, respectivamente. Em comparação com o genótipo GT+TT, o GG está relacionado à diminuição da sobrevida livre de eventos e aumento do risco13. Isso sugere que rs442767 pode levar a certa influência potencial no 5-FU.

A metionina sintase (MTR) catalisa a remetilação da homocisteína em metionina, que desempenha um papel importante no metabolismo do folato. MTR rs1805087 é o polimorfismo mais comum do gene MTR . O MTR rs1805087 substitui o ácido aspártico por glicina no local potencialmente funcional da proteína, o que pode diminuir a atividade do MTR. Indivíduos com o alelo G apresentaram aumento do nível plasmático de folato e diminuição do nível plasmático de homocisteína14. Pelo contrário, um estudo mostrou que rs1805087 não tem associação estatisticamente significativa com a eficácia do 5-FU. Mas este estudo se concentrou no câncer colorretal e o tamanho da amostra foi pequeno. A relação entre rs1805087 e a eficácia do 5-FU em pacientes com câncer gástrico ainda precisa ser explorada15.

A gama-glutamil hidrolase (GGH) é uma enzima lisossômica que regula as concentrações intracelulares de folato. Ácido pteroilglutâmico é sinônimo de ácido fólico composto de pterina, ácido p-aminometilbenzóico e ácido glutâmico. Existem duas formas de ácido fólico nos organismos, folato monoglutamato e folato poliglutamado. O poliglutamato de THF é enzimaticamente convertido em folato monoglutâmico pelo GGH, liberando sucessivamente monoglutamato (mono-Glu) ou di-glutamato (di-Glu)16. Um estudo sobre a expressão de GGH em pacientes com câncer gástrico localmente avançado mostrou que a alta expressão de GGH poderia reduzir o 5,10-MTHF e o TS, o que significa que apenas uma pequena dose de 5-FU é necessária para atingir o efeito inibitório do TS nesses pacientes17. O GG é um biomarcador prognóstico em pacientes com câncer gástrico localmente avançado tratados com quimioterapia adjuvante pós-operatória com S-1, um pró-fármaco do 5-FU, e desempenha um papel importante na manutenção da homeostase intracelular do ácido fólico18. GGH rs11545078 é uma variante missense e altera Thr-127 para Ile-127. Um estudo com foco na especificidade do substrato do GGH sugere que rs11545078, em comparação com o tipo selvagem, resulta em maior Km e menor eficiência catalítica para o metotrexato e a estrutura é semelhante ao ácido fólico19. Juntos, explorar a relação entre rs11545078 e os resultados clínicos do 5-FU é uma estratégia promissora para entender a resistência aos medicamentos.

O membro 1 da família de transportadores de soluto 19 (SLC19A1), também denominado transportador de folato reduzido, é uma proteína transmembrana facilitadora típica que importa folatos reduzidos que as células de mamíferos não têm a capacidade de sintetizar de novo, o que é reconhecido por estimar a resposta do tumor ao 5-FU20. No entanto, poucos estudos foram realizados sobre a associação entre 5-FU e polimorfismo SLC19A1 21. Em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas que receberam pemetrexedo, que é um análogo do folato, o rs1051298 no gene SLC19A1 contribuiu para aumentar o risco de todas as reações adversas a medicamentos e diminuir a sobrevida global22,23. SLC19A1 rs1051298, uma variante da região 3’não traduzida sobre o metabolismo do folato, pode ajudar a explicar algumas das diferenças individuais sobre a terapia com 5-FU. Aqui, o objetivo é avaliar a associação entre rs1051298 e resistência ao 5-FU entre pacientes com câncer gástrico.

Um kit, baseado em sequenciamento de semicondutores, é usado para detecção qualitativa de genes in vitro (Figura 1), que pode detectar 7 SNPs selecionados em 5 genes, as mutações rs1801131 e rs1801133 do gene MTHFR , mutações rs1650697 e rs442767 do gene DHFR , mutação rs1805087 do gene MTR , mutação rs11545078 do gene GGH e rs1051298 de SLC19A1 gene em amostras de tecido tumoral de pacientes com câncer gástrico. Primeiramente, o ácido nucléico da amostra foi extraído e o fragmento alvo foi especificamente amplificado por PCR. Um adaptador de sequenciamento universal foi adicionado em ambas as extremidades do fragmento de DNA para construir uma biblioteca que pode ser usada para sequenciamento. Em seguida, foi feita a amplificação da biblioteca de sequenciamento por PCR para formar um modelo de sequenciamento. O modelo positivo foi enriquecido para atender aos requisitos de sequenciamento. Usando o sistema de sequenciamento de semicondutores, fixando a fita de DNA no pequeno orifício do chip semicondutor. A DNA polimerase toma o DNA de fita simples como molde e sintetiza a fita de DNA complementar de acordo com o princípio do emparelhamento de bases complementares. Cada vez que uma base é estendida em uma cadeia de DNA, um próton será liberado, causando mudanças locais de pH. Um sensor iônico detecta mudanças de pH e converte sinais químicos em sinais digitais, para que as bases possam ser interpretadas em tempo real e, finalmente, a sequência de bases de cada segmento de DNA possa ser obtida. A análise de bioinformática foi usada para combinar essas sequências com o mapa de referência do genoma humano. Quando os genes relacionados ao câncer gástrico sofrem mutação, suas sequências de bases de DNA correspondentes mudam, de modo a obter as informações de mutação dos genes relacionados.

O resultado pode exibir o status de mutação genética e fornecer referência para os médicos selecionarem tipos e dosagens apropriados de medicamentos quimioterápicos e prever a resistência aos medicamentos para pacientes com câncer gástrico. No entanto, os resultados dos testes são apenas para referência clínica e não são recomendados como a única base para o tratamento individualizado dos pacientes. Os médicos devem fazer um julgamento abrangente com base na condição do paciente, indicações de medicamentos, reações ao tratamento e outros indicadores de testes laboratoriais.

Protocol

Todos os protocolos e as amostras de tecido de câncer gástrico (etapa 1), obtidas por endoscopia digestiva alta ou cirurgia, utilizados neste estudo foram revisados e aprovados pelo comitê de ética médica em 24 de julho de 2023 (NFEC-2023-298). Além disso, este protocolo foi projetado exclusivamente para ilustrar a detecção de vários genes no câncer gástrico sem se envolver em comparações de coorte, portanto, não impõe critérios específicos para incluir ou excluir pacientes. Os pacientes/participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para participar deste estudo. 1. Preparação de blocos embutidos de câncer gástrico Configure o sistema de incorporação de tecidos, composto por um reservatório e dispensador de parafina, ao lado de placas quentes e frias, seguindo as diretrizes operacionais prescritas. Extraia o tecido preparado para incorporação do desidratador e deposite-o na ranhura de armazenamento do centro de incorporação. Selecione os moldes de incorporação adequados com base no tamanho do tecido, despeje uma quantidade suficiente de parafina derretida para cobrir o tecido e, em seguida, posicione o molde na placa quente. Recupere o tecido dos e coloque a mucosa gástrica perpendicular à base do molde de incorporação para garantir que o plano da seção transversal corte todas as camadas do tecido. Alinhe o tecido no molde. Coloque o na parte superior do molde, seguido por um vazamento secundário de parafina, preenchendo o molde. Coloque o molde embutido na placa fria e, após a solidificação da parafina, retire os blocos embutidos dos moldes. 2. Extração de ácido nucleico de amostras Use kits de extração e purificação de ácidos nucleicos para extrair ácidos nucléicos de amostras de tecido embebidas em parafina. Use um quantificador de ácido nucleico para quantificar o ácido nucléico extraído. Recomenda-se que a concentração de ácido nucleico seja superior a 2 ng/μL.NOTA: Os materiais usados aqui estão disponíveis na Tabela de Materiais. 3. Preparação para biblioteca de sequenciamento Preparação antes do experimentoLigue a lâmpada UV na bancada ultralimpa, esterilize por 30 min. Em seguida, desligue a lâmpada UV e ligue o ventilador para ventilar por 10 min. Retire o ácido nucleico do refrigerador de -20 ± 5 °C., verifique e registre o ID da amostra, o código de barras do ácido nucleico e o número específico da etiqueta da etiqueta atribuída à amostra. Coloque-o no suporte do tubo da centrífuga para dissolução à temperatura ambiente (RT) após a verificação e centrifugue-o por 10 s, com um fixo de 2.500 x g para espera. Amplificação por PCR do fragmento alvoPegue a solução de reação de captura de fragmentos, o primer de amplificação de câncer gástrico e o primer de amplificação de fusão do kit de detecção de juntas multigênicas de câncer gástrico feito sob medida e coloque-os no gelo para derreter. Agite e misture após derreter, centrifugue por 10 s e prepare água sem nuclease. Informações detalhadas do primer são mostradas na Tabela 1.NOTA: O kit ainda não está disponível comercialmente, entre em contato com os autores para obter mais detalhes. Prepare um tubo de reação de PCR de 0,2 mL, adicione reagentes ao tubo sucessivamente de acordo com a Tabela Suplementar 1, vortex e misture por 5 s e centrifugue instantaneamente por 10 s, com 2.500 x g fixos, para que não haja gotas óbvias na parede e na tampa do tubo. As amostras de RNA devem ser transcritas reversamente em cDNA e, em seguida, usadas para a construção subsequente da biblioteca. Os produtos de cDNA devem ser adicionados sucessivamente aos tubos, de acordo com a Tabela Suplementar 2. Coloque cada tubo de reação no termociclador. Para as amostras de DNA, execute o programa de amplificação conforme detalhado na Tabela 2. Para produtos de cDNA, execute o programa de amplificação conforme detalhado na Tabela 3. Digestão da sequência de primersRetire a enzima de digestão do primer e coloque-a no gelo para derreter. Após a amplificação, retire os tubos de reação acima, adicione 2 μL de enzima de digestão de primer a cada tubo e certifique-se de que o volume total seja de 22 μL. Vortex e misture a solução de reação no tubo de PCR e centrifugue instantaneamente por 10 s, com um valor fixo de 2.500 x g. Coloque cada tubo de reação no termociclador e execute o programa conforme detalhado na Tabela 4. Ligadura do adaptadorColoque o adaptador que conecta os reagentes no gelo para dissolver. Prepare o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e, em seguida, misture cada componente de acordo com a Tabela 5 e marque-o como mistura adaptadora X.NOTA: Os reagentes de conexão do adaptador incluem adaptadores P1 e adaptadores específicos X, numerados de 1 a 48. Eles são projetados para marcar várias amostras de forma exclusiva. Ao adicionar um adaptador específico, abra apenas um tubo de cada vez para evitar a contaminação cruzada do adaptador específico. A mistura diluída do adaptador específico pode ser armazenada a -20 ± 5 °C para standby. Nos fluxos de trabalho de sequenciamento, as amostras não são processadas individualmente, em vez disso, várias amostras, cada uma marcada com um adaptador específico, são combinadas em uma biblioteca unificada, para sequenciamento. Este método permite a diferenciação subsequente de amostras com base em suas sequências adaptadoras específicas. Retire o produto primário digerido (22 μL) do termociclador. Adicione reagentes no tubo sucessivamente de acordo com a Tabela 6, vortex e misture por 5 s. Centrifugue em baixa velocidade por 10 s, com um fixo de 2.500 x g, para que não haja queda óbvia na parede e na tampa do tubo. Coloque o tubo de reação no termociclador. Para as amostras de DNA, execute o programa de amplificação conforme detalhado na Tabela 7. Para produtos de cDNA, execute o programa de amplificação conforme detalhado na Tabela 8. Purificação do produto de ligação e amplificaçãoRetire as esferas magnéticas de purificação de DNA da geladeira de 2 a 8 ° C com antecedência, vortexe-as uniformemente e centrifugue-as instantaneamente por 10 s, com um fixo de 2.500 x g. Equilibre as esferas magnéticas em RT por 30 min. Prepare um tubo de microcentrífuga de baixa adsorção de 1,5 mL e transfira o produto da reação de ligadura para o tubo correspondente. Adicione 45 μL de esferas magnéticas purificadas de DNA em cada tubo, vórtice e misture bem, centrifugue instantaneamente por 10 s e incube em RT por 5 min. Coloque o tubo em um rack magnético por 3 min. Descarte o sobrenadante e evite pipetar as contas. Transfira 300 μL de etanol a 75% recém-preparado para o tubo da microcentrífuga e gire suavemente os tubos 4x a 180°. Depois que a solução estiver clara, descarte rapidamente o sobrenadante. Evite pipetar as contas para fora. Repita o procedimento de lavagem 1x mais. Remova os tubos de microcentrífuga de 1.5 mL do suporte magnético e centrifugue brevemente (10 s, com 2.500 x g fixos). Coloque os tubos de volta no suporte magnético e pipete o líquido restante. Certifique-se de que não haja líquido residual na parede do tubo. Abra a tampa de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e seque os grânulos em RT por 5 min. Preste atenção à condição seca-úmida das contas. Depois que as esferas magnéticas estiverem secas, verifique se não há manchas de água na superfície. Prolongue o tempo de secagem adequadamente se os grânulos magnéticos estiverem demasiado molhados. Feche a tampa imediatamente se surgir alguma rachadura nas contas e continue a próxima etapa para amplificar e purificar a biblioteca. Ampliação e purificação da bibliotecaColoque os reagentes relacionados à PCR no gelo para dissolução com antecedência, vórtice-os e centrifugue-os por 10 s. Remova o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL do suporte magnético, pipete os regentes de PCR no tubo de acordo com a Tabela 9 e feche a tampa e o vórtice por 5s. Centrifugue brevemente (10 s) para que não haja gota de líquido óbvia na parede e na tampa do tubo. Transfira o produto acima para um novo tubo de PCR. Incube a amostra em um termociclador. Para as amostras de DNA, execute o programa de amplificação conforme detalhado na Tabela 10. Para produtos de cDNA, execute o programa de amplificação conforme detalhado na Tabela 11. Prepare um novo tubo de microcentrífuga de baixa adsorção de 1,5 mL. Centrifugue o tubo de PCR por 10 s após a incubação. Transfira o produto do tubo PCR para o tubo EP. Adicione 25 μL de esferas magnéticas purificadas de DNA em cada tubo. Vortex e misture bem, centrifugue em baixa velocidade e incube em RT por 5 min. Coloque os tubos em um rack magnético por 3 min e espere até que a solução fique límpida. Transfira o sobrenadante para novos tubos de microcentrífuga. Evite pipetar as contas para fora. Adicione 60 μL de esferas magnéticas purificadas de DNA em cada tubo. Vortex e misture bem, centrifugue em baixa velocidade e incube em RT por 5 min. Coloque os tubos em um rack magnético por 3 min e espere até que a solução fique límpida. Descarte o sobrenadante. Evite pipetar as contas para fora. Transfira 300 μL do etanol a 75% recém-preparado para os tubos e gire suavemente os tubos 4x a 180°. Depois que a solução estiver límpida, pipete rapidamente e descarte o sobrenadante. Evite pipetar as contas para fora. Repita o procedimento de lavagem 1x. Remova os tubos de microcentrífuga de 1.5 mL do rack magnético e centrifugue brevemente (10 s). Insira os tubos de volta no rack magnético e pipete o líquido restante. Certifique-se de que não haja líquido residual na parede do tubo. Abra as tampas dos tubos de 1,5 mL e seque as esferas em RT por 5 min. Preste atenção à condição seca-úmida das contas. Depois que as esferas magnéticas são secas, não há mancha de água na superfície. Prolongue o tempo de secagem adequadamente se os grânulos magnéticos estiverem demasiado molhados. Feche a tampa imediatamente se surgir alguma rachadura nas contas. Pipetar 50 μL de eluente para os tubos, vórtice e misturar bem. Centrifugue brevemente (5 s, com 2.500 x g fixos) e coloque os tubos em RT por 5 min. Coloque os tubos em um rack magnético por 3 min e espere até que a solução fique límpida. Remova cuidadosamente o líquido em um novo tubo e marque o nome da biblioteca. Armazene o biblioteca em uma geladeira a 2-8 ° C temporariamente e aguarde a determinação quantitativa ou armazene a biblioteca em uma geladeira a -20 ± 5 ° C para armazenamento de longo prazo. 4. Quantificação da biblioteca construída Use o quantificador de ácido nucleico para quantificar a biblioteca. Se a concentração da biblioteca for ≥ 0,2 ng/μL, ela é qualificada. Caso contrário, reconstrua a biblioteca. Misture o mesmo volume de DNA (ou RNA) e quantifique a solução. De acordo com o resultado quantitativo, diluir a solução misturada a 100 pmol/L utilizando a seguinte fórmula.NOTA: Uma alternativa é diluir a biblioteca para 100 pmol/L de acordo com a fórmula e, em seguida, quantificar por PCR quantitativo fluorescente. Misture bibliotecas de DNA (ou RNA) igualmente de acordo com os resultados quantitativos do instrumento de PCR. Misture 100 pmol/L de biblioteca de DNA e biblioteca de RNA na proporção de 4:1. Use a solução mista de biblioteca de DNA e RNA para sequenciamento de computador. 5. Sequenciamento Realize o sequenciamento consultando o manual do kit universal de reação de sequenciamento24,25 (método de sequenciamento de semicondutores). 6. Controle de qualidade de amostras Controle de qualidade positivo do DNA do câncer gástrico: Pegue o controle positivo do DNA do câncer gástrico e faça o teste de acordo com as instruções do kit. O controle é fornecido com o kit. O resultado mostra que os mutantes dos genes MTHFR, DHFR SLC19A1, MTR, GGH e são detectados. Controle de qualidade negativa do DNA do câncer gástrico: Pegue o controle negativo do DNA do câncer gástrico e realize o teste de acordo com as instruções do kit. O controle é fornecido com o kit. O resultado mostra que os tipos selvagens de genes MTHFR, DHFR SLC19A1 MTR, GGH e são detectados.NOTA: Certifique-se de que os critérios sejam atendidos em ambos os casos, caso contrário, será necessária uma nova detecção. 7. Análise dos dados Execute o plug-in correspondente (o software Variant Caller, Coverage Analysis e Ion Reporter) no software Torrent Suite para obter os resultados da análise das amostras. Julgue os resultados da detecção de amostra de acordo com os resultados da análise do plug-in.

Representative Results

A determinação dos resultados do teste depende do valor de julgamento positivo, que também é reconhecido como intervalo de referência. Use o método de sequenciamento de semicondutores para detectar as amostras clínicas coletadas. Quando o valor da frequência de mutação dos genes MTHFR, DHFR, MTR, GGH e SLC19A1 é ≥ 5%, o resultado da detecção é o mutante do gene correspondente. Quando o valor da frequência de mutação é < 5 %, o resultado da detecção é o tipo selvagem do genecorrespondente 26. Os critérios a seguir podem ser usados para determinar se os resultados da detecção são confiáveis. Em primeiro lugar, se a cobertura média dos resultados do sequenciamento de DNA for ≥ 500 e as leituras mapeadas dos resultados do sequenciamento de RNA forem ≥ 20000, os resultados do teste são confiáveis27. Caso contrário, é recomendável testar novamente. Em segundo lugar, a cobertura média do controle de qualidade positivo do DNA do câncer gástrico é de ≥ 500, e o resultado do teste deve estar em conformidade com as mutações rs1801131 e rs1801133 do gene MTHFR , mutações rs1650697 e rs442767 do gene DHFR , mutação rs1805087 do gene MTR , mutação rs11545078 do gene GGH e mutação rs1051298 do SLC19A1 gene como positivo. Caso contrário, é recomendável testar novamente. Em terceiro lugar, a cobertura média do controle de qualidade negativo do DNA do câncer gástrico é ≥ 500, e os resultados da detecção devem mostrar que todos os locais dentro da faixa de detecção deste kit são do tipo selvagem. Caso contrário, é recomendável testar novamente. Por fim, a concentração da biblioteca é inferior a 0,2 ng/μL, o que pode ser devido à degradação do DNA ou RNA na amostra, ou à falha em seguir rigorosamente o processo experimental ou o uso de reagentes vencidos durante o experimento. As condições acima podem fazer com que a qualidade do sequenciamento diminua ou falhe. Recomenda-se reconstruir a biblioteca. Com este kit, uma série de etapas é seguida para construir uma biblioteca de sequenciamento a partir de amostras clínicas. A biblioteca é então sequenciada em uma plataforma de sequenciamento de semicondutores de íons, com ANNOVAR usado para anotar os resultados. Após o sequenciamento, um documento é usado para resumir os tipos de mutantes para cada amostra. A ausência de um tipo mutante indicou que a amostra não sofreu essa mutação específica. A Tabela Suplementar3 fornece um exemplo típico disso. A Tabela 12 inclui informações básicas sobre os SNPs detectados aqui. Analisando cada SNPs usando anotação baseada em filtro em vários bancos de dados, como 1000 Genomes Project (1000g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; Tabela 13) e o Consórcio de Agregação de Exoma (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Tabela 14), pode revelar que diferentes SNPs estão significativamente presentes em diferentes populações. Figura 1: Diagrama de fluxo para o protocolo. Fluxograma de detecção multigênica para câncer gástrico usando o método de sequenciamento de semicondutores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Cromossomo Localização Intervalo de design do primer Primer esquerdo Primer direito chr1 11854475 CHR1:11854175-11854775 AÇAGGGGGAAGTCACAG AAACCGGAATGGTCACAAAG 11856377 CHR1: 11856077-11856677 CTTCAGGTCAGCCTCAAAGC TCCCTGTGGTCTCTTCATCC chr5 79950780 CHR5: 79950480-79951080 CGCCGCACATAGTAGGTTCT CTTCCTCCTCCAGCCCTATC 79951495 CHR5:79951195-79951795 CTTGGGTCACCTGCACAGTA ATTTTGAAGCACCCAAGCTG chr1 237048499 CHR1:237048199-237048799 GTCAAAGGCCAGTCCCTTCT CTCCCTTCACCAACTGTGCT chr8 63938763 CHR8:63938463-63939063 CAGTGAAGTTCAGCGGCAT TATTTTCCTGTGTGGGGCAC chr21 46934825 CHR21:46934525-46935125 CCAACCTGAGATGGCTTTTC TCCTTGGTGCTCTTGCTTTT Tabela 1: Primers usados para os sete SNPs selecionados em cinco genes. Esta folha exibe as informações sobre a localização dos primers de SNPs associados à resistência ao 5-FU no câncer gástrico. Temperatura Hora Não. de ciclos 99 °C 2 min 1 ciclo 99 °C 15 s 22 ciclos 60 °C 4 minutos 10 °C Segurar 1 ciclo Tabela 2: Programa de ciclo térmico para amplificação de DNA. As condições de reação térmica, como temperatura, tempo e ciclos, são mostradas. Passo Temperatura Hora Não. de ciclos Ativar enzimas 99 °C 2 min 1 ciclo Desnaturar 99 °C 15 s 30 ciclos Recozer e estender 60 °C 4 minutos Preservar 10 °C Segurar 1 ciclo Tabela 3: Programa de ciclo térmico para amplificação de cDNA. As condições de reação térmica, como temperatura, tempo e ciclos, são mostradas. Temperatura Hora Não. de ciclos 50 °C 10 minutos 1 ciclo 55 °C 10 minutos 1 ciclo 60 °C 20 minutos 1 ciclo 10 °C Segurar 1 ciclo Tabela 4: Programa de ciclo térmico para digestão da sequência de primers. As condições de reações térmicas, como temperatura, tempo e ciclos, são mostradas. Componente Volume Adaptador P1 1,5 μL Adaptador específico X 1,5 μL Água livre de nuclease 3 μL Volume total do sistema de reação 6 μL X: Indica o número específico do adaptador Tabela 5: Sequência de adição de reagentes para preparação da mistura adaptadora. Adicione reagentes ao tubo na ordem fornecida aqui. Componente Volume Buffer de conexão 4 μL Mistura de adaptador X 2 μL DNA ligase 2 μL Volume total do sistema de reação 30 μL Tabela 6: Sequência de adição de reagentes na produção de primer digerido. Adicione reagentes ao tubo na ordem fornecida aqui. Temperatura Hora Não. de ciclos 22 °C 30 min 1 ciclo 72 °C 10 minutos 1 ciclo 10 °C Segurar 1 ciclo Tabela 7: Programa de ciclo térmico para conectar o adaptador ao DNA. As condições de reações térmicas, como temperatura, tempo e ciclos, são mostradas. Temperatura Hora Não. de ciclos 22 °C 30 min 1 ciclo 68 °C 5 min 1 ciclo 72 °C 5 min 1 ciclo 10 °C Segurar 1 ciclo Tabela 8: Programa de ciclo térmico para conectar o adaptador ao cDNA. As condições de reações térmicas, como temperatura, tempo e ciclos, são mostradas. Componente Volume Solução de reação de amplificação de biblioteca 50 μL Mistura de primer de biblioteca 2 μL Volume total do sistema de reação 52 μL Tabela 9: Sequência de adição de reagentes de amplificação. Adicione reagentes ao tubo na ordem fornecida aqui. Temperatura Hora Não. de ciclos 98 °C 2 min 1 ciclo 98 °C 15 s 5 ciclos 60 °C 1 minuto 10 °C Segurar 1 ciclo Tabela 10: Programa de ciclo térmico para amplificação da biblioteca de DNA. As condições de reações térmicas, como temperatura, tempo e ciclos, são mostradas. Temperatura Hora Não. de ciclos 98 °C 2 min 1 ciclo 98 °C 15 s 5 ciclos 64 °C 1 minuto 10 °C Segurar 1 ciclo Tabela 11: Programa de ciclo térmico para amplificação da biblioteca de cDNA. As condições de reações térmicas, como temperatura, tempo e ciclos, são mostradas. rs1801131 rs1801133 rs1650697 rs442767 rs1805087 rs11545078 rs1051298 Ref T G Um G Um G G Alt G Um G T G Um Um Func.refGeneWithVer exônico exônico UTR5 montante exônico exônico UTR3 Gene.refGeneWithVer MTHFR MTHFR DHFR DHFR MTR GGH SLC19A1 Detalhe do Gene.refGeneWithVer . . NG_023304.1:g.5020T>G . . . NM_001205206.1:c.*64C>T;NM_001205207.1:c.*746C>T;NM_194255.2:c.*746C>T ExônicoFunc.refGeneWithVer não sinônimo;SNV não sinônimo;SNV . . não sinônimo;SNV não sinônimo;SNV . AAChange.refGeneWithVer MTHFR:NM_001330358.1:exon8:c.A1409C:p.E470A; MTHFR:NM_005957.4:exon8:c.A1286C: p.E429A MTHFR:NM_001330358.1:exon5:c.C788T:p.A263V; MTHFR: NM_005957.4:exon5: c.C665T:p.A222V . . MTR:NM_001291939.1:exon25:c.A2603G:p.D868G; MTR: NM_001291940.1:exon25:c.A1535G: p.D512G;MTR:NM_000254.2: exon 26: c.A2756G: p.D919G GGH:NM_003878.2:exon5:c.C452T:p.T151I Jin cytoBand 1p36.22 1p36.22 5Q14.1 5Q14.1 1º trimestre de 43 8q12.3 21q22.3 Tabela 12: Informações relevantes dos SNPs. Anotando as amostras usando ANNOVAR. MTHFR DHFR MTR GGH SLC19A1 rs1801131 rs1801133 rs1650697 rs442767 rs1805087 rs11545078 rs1051298 1000g2015aug_all 0.249401 0.245407 0.76857 0.290136 0.218251 0.085463 0.524361 1000g2015aug_afr 0.1513 0.09 0.9349 0.0318 0.2844 0.056 0.5772 1000g2015aug_amr 0.1513 0.4741 0.755 0.3991 0.1772 0.0403 0.4323 1000g2015aug_eas 0.2192 0.2956 0.6607 0.5853 0.1052 0.0873 0.5635 1000g2015aug_eur 0.3131 0.3648 0.7555 0.3191 0.173 0.0924 0.4493 1000g2015aug_sas 0.4172 0.1186 0.6779 0.228 0.3211 0.1483 0.5552 Tabela 13: Anotação baseada em filtro de SNPs no Projeto 1000 Genomas. MTHFR DHFR MTR GGH SLC19A1 rs1801131 rs1801133 rs1650697 rs442767 rs1805087 rs11545078 rs1051298 ExAC_ALL 0.295 0.3037 . . 0.2091 0.0936 . ExAC_AFR 0.1588 0.1124 . . 0.2666 0.0545 . ExAC_AMR 0.1555 0.5141 . . 0.1864 0.0361 . ExAC_EAS 0.2148 0.3052 . . 0.1132 0.0824 . ExAC_FIN 0.3128 0.2227 . . 0.1892 0.0581 . ExAC_NFE 0.3191 0.345 . . 0.1919 0.0969 . ExAC_OTH 0.304 0.3062 . . 0.2108 0.0973 . ExAC_SAS 0.4153 0.1409 . . 0.316 0.165 . Tabela 14: Anotação baseada em filtro de SNPs no Exome Aggregation Consortium. Tabela Suplementar 1: Sequência de adição de reagentes para amplificação de DNA. Adicione reagentes ao tubo na ordem fornecida aqui. Clique aqui para baixar este arquivo. Tabela suplementar 2: Sequência de adição de reagentes para amplificação de cDNA. Adicione reagentes ao tubo na ordem fornecida aqui. Clique aqui para baixar este arquivo. Tabela Suplementar 3: Exemplo de resultados de sequenciamento de amostras clínicas. Apenas as mutações presentes nos espécimes serão registradas nos documentos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Especialistas clínicos concordam unanimemente que os pacientes, mesmo com o mesmo tipo e estágio de câncer gástrico, podem ter respostas marcadamente diferentes a uma abordagem de tratamento idêntica. Anos de pesquisa revelaram aos cientistas que as variações individuais são atribuídas principalmente à natureza do câncer gástrico como uma população celular heterogênea, polimórfica e diversamente diferenciada, levando a disparidades individuais significativas nas respostas ao tratamento28. Consequentemente, a aquisição de amostras de câncer gástrico por meio de endoscopia digestiva alta ou cirurgia e amostras de sangue, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento para análise genética, permite o tratamento personalizado do câncer gástrico. Essa estratégia é projetada para aumentar a eficácia do tratamento clínico e reduzir o risco de efeitos colaterais tóxicos graves. O progresso na tecnologia de sequenciamento de semicondutores iônicos transformou o tratamento personalizado em uma realidade prática29.

Aqui estão algumas limitações deste método de teste. O kit usado aqui é principalmente para diagnóstico in vitro , portanto, limita-se a detectar a mutação de rs1801131 e rs1801133 do gene MTHFR , rs1650697 e rs442767 do gene DHFR , rs1805087 do gene MTR , rs11545078 do gene GGH e rs1051298 de SLC19A1. A mutação em outras seções não pode ser detectada. Devido à heterogeneidade significativa no tecido tumoral, diferentes locais de amostragem podem afetar os resultados da detecção. Para amostras de tecido embebidas em parafina armazenadas por mais tempo, o DNA e o RNA podem ser degradados até certo ponto, afetando os resultados do teste. Coleta, transporte e processamento de amostras irracionais, bem como operação experimental inadequada e ambiente experimental podem levar a resultados falsos negativos ou falsos positivos. O resultado da detecção não pode ser garantido se a concentração de ácido nucleico for inferior a 2 ng/μL. Os resultados dos testes do kit são apenas para referência clínica. A seleção do tratamento personalizado para os pacientes deve ser considerada em combinação com seus sintomas/sinais, histórico médico, outros exames laboratoriais e reações ao tratamento. Os resultados negativos não podem excluir completamente a existência de mutação do gene alvo. Os resultados negativos também podem ser causados por poucas células tumorais na amostra, degradação excessiva do ácido nucléico ou concentração do gene alvo no sistema de reação de amplificação abaixo do limite de detecção.

Alguns índices de desempenho do kit utilizado são os descritos. Sensibilidade analítica: Para amostras de DNA, a quantidade mínima detectável do ácido nucléico total neste kit é de 10 ng, e uma taxa de mutação de 5% pode ser detectada. Para amostras de RNA, a quantidade mínima detectável do ácido nucléico total neste kit é de 10 ng. Taxa de coincidência positiva e negativa: A taxa de coincidência positiva e negativa chega a 100%. Limite de detecção (LOD): Um total de 14 referências LOD, numeradas L1-L14 podem ser usadas. L1-L11 são referências LOD dos genes MTHFR, DHFR, MTR, GGH e SLC19A1 , e seus resultados de detecção devem ser que os tipos de mutação dos locais dos genes correspondentes são positivos e as taxas de coincidência são de 100%. Repetibilidade: Um total de cinco materiais de referência repetitivos, numerados R1-R5 podem ser usados. R1 é um material de referência repetitivo positivo forte (mutação rs67376798 do gene DPYD ). R2, que contém essa mutação em menor número, é um material de referência repetitivo positivo fraco (mutação rs67376798 do gene DPYD ), R3 é um material de referência repetitivo negativo (6 locais dos genes DPYD, MTHFR e ABCB1 são detectados como tipo selvagem). Cada amostra de referência deve ser testada 10 vezes, garantindo que os resultados dessas avaliações repetidas correspondam às suas classificações predefinidas. Volume de dados: O volume efetivo de dados de amostras de DNA e RNA deve ser controlado acima de 0,05 M. A profundidade de sequenciamento das amostras de DNA deve ser controlada acima de 500, e as leituras mapeadas das amostras de RNA devem ser controladas acima de 20000. Teste de interferência: Este kit não é afetado por substâncias de interferência endógena (triglicerídeos e albumina) e substâncias de interferência exógenas (formalina e álcool desidratado).

Algumas precauções devem ser observadas durante o experimento. O kit usado aqui só pode ser usado para testes in vitro. Leia este manual cuidadosamente antes do experimento e use-o dentro do período de validade. Componentes do kit em lotes diferentes não podem ser usados de forma intercambiável. Recomenda-se o uso de consumíveis descartáveis para este kit para evitar contaminação. Durante o uso deste kit, recomenda-se o uso de uma cabeça de sucção com um elemento filtrante. A fim de evitar quaisquer riscos biológicos potenciais na amostra, a amostra de teste deve ser considerada como substância infecciosa para evitar o contato com a pele e a membrana mucosa. Recomenda-se manusear as amostras em um gabinete de biossegurança que possa impedir a saída de aerossóis. Tubos de ensaio e ventosas usados na operação devem ser esterilizados antes de serem descartados. A operação e o descarte de amostras devem atender aos requisitos das leis e regulamentos relevantes: Diretrizes Gerais para Biossegurança de Laboratórios Biomédicos Microbianos e Regulamentos de Gerenciamento de Resíduos Médicos do Ministério da Saúde30,31. O pessoal experimental deve receber treinamento profissional, operar em estrita conformidade com as instruções e separar estritamente as áreas de acordo com o processo experimental. Em cada fase da operação experimental, devem ser utilizados instrumentos e equipamentos especiais, e os artigos de cada fase de cada área não devem ser utilizados indistintamente. O pessoal experimental deve separar estritamente as áreas de acordo com o processo experimental. Devem ser utilizados instrumentos e equipamentos especiais em cada fase da operação experimental. Tome medidas de proteção conforme necessário, como luvas, roupas de trabalho, etc. A eliminação de resíduos deve estar em conformidade com os regulamentos nacionais pertinentes.

Embora o foco deste artigo esteja nos sete SNPs dentro de cinco genes relacionados ao câncer gástrico, o sequenciamento em aplicações práticas não se limita apenas a esses cinco genes. Este artigo estabelece definitivamente uma correlação significativa entre os sete SNPs e a sensibilidade à quimioterapia 5-FU no câncer gástrico.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo é apoiado por Explorando o Mecanismo e o Papel da Via ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL na Resistência de Células de Câncer Gástrico à Ferroptose Induzida por Apatinibe (Número do item: 82172814), apoiado pela National Nature Science Foundation da China; Investigando o papel e o mecanismo do fator de transcrição 1 do dedo de zinco na modulação da resistência das células de câncer gástrico à ferroptose induzida pelo apatinibe através da via fosfolipídica do éter poliinsaturado (número do item: 2022A1515010267), apoiado pelo Comitê Provincial de Guangdong para o Financiamento de Pesquisa Básica e Aplicada; e a Pesquisa e Aplicação de Reagente para o Diagnóstico de Quimiossensibilidade 5-FU para Câncer Gástrico (Número do item: 201903010072), Projetos de Ciência e Tecnologia em Guangzhou.

Materials

1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
Amplification primer of gastric cancer Thermo Fisher The primers are sythesized by Thermo Fshier according to the sequence in Table 1.
Deparaffinization Qiagen 19093
DNA purification magnetic beads Bechkman A63881
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent
Factory Thermo Fisher Scientific		 http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher 4480441
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Pipette tips  Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
PureLink RNA Mini Columns Thermo Fisher A29839
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit Thermo Fisher AM1975
Tabletop mini centrifuge SCILOGES S1010E
Thermal Cycler Life Technologies 4375786
Ultramicro nucleic acid analyzer BEIJING ORIENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT LTD. BD-1000
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References

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Huang, K., Yan, X., Huang, Z., Liang, H., Li, Z., Wang, M., Wan, Y., Wang, S., Zhao, L. Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (207), e66058, doi:10.3791/66058 (2024).
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