JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

الكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة متعددة الجينات في سرطان المعدة على أساس منصة تسلسل أشباه الموصلات الأيونية

Published: May 10, 2024
doi:
10.3791/66058
, , , , , , , ,
1Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2Research and Development Department,Guangzhou Darui Biotechnology Co., Ltd, 3Key Laboratory of Antibody Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University, 4Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy,Southern Medical University

Summary

يقترح هذا البروتوكول إجراءات معملية شاملة مطلوبة للكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في عينات سرطان المعدة بناء على منصة تسلسل أشباه الموصلات الأيونية. كما يتم وصف التسلسلات المستهدفة ، ومحولات الربط ، وتضخيم المكتبة وتنقيتها ، ومعايير مراقبة الجودة بالتفصيل.

Abstract

سرطان المعدة هو ورم غير متجانس شائع. يعاني معظم المرضى من سرطان المعدة المتقدم في وقت التشخيص وغالبا ما يحتاجون إلى العلاج الكيميائي. على الرغم من أن 5-فلورويوراسيل (5-FU) يستخدم على نطاق واسع للعلاج ، إلا أن حساسيته العلاجية وتحمله للأدوية لا تزال بحاجة إلى تحديد ، مما يؤكد على أهمية الإدارة الفردية. يمكن أن يوجه علم الوراثة الدوائية التنفيذ السريري للعلاج الفردي. يساهم تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) ، كعلامة وراثية ، في اختيار أنظمة وجرعات العلاج الكيميائي المناسبة. ترتبط بعض SNPs باستقلاب حمض الفوليك ، وهو الهدف العلاجي ل 5-FU. اختزال ميثيلين تتراهيدروفولات (MTHFR) rs1801131 و rs1801133 ، اختزال ثنائي هيدروفولات (DHFR) rs1650697 و rs442767 ، سينسيز الميثيونين (MTR) rs1805087 ، هيدرولاز جاما جلوتاميل (GGH) rs11545078 وعائلة حامل المذاب 19 عضو 1 (SLC19A1) rs1051298 تم التحقيق فيها في أنواع مختلفة من السرطانات والأدوية المضادة للأورام المضادة للفولات ، والتي لها تنبؤ محتمل وأهمية توجيهية ل تطبيق 5-FU. يمكن لتقنية تسلسل أشباه الموصلات من الجيل التالي من التورنت الأيوني أن تكتشف بسرعة SNPs المرتبطة بسرطان المعدة. في كل مرة يتم فيها تمديد قاعدة في سلسلة الحمض النووي (DNA)، ينطلق H+ وهو ما يتسبب في تغيرات موضعية في الأس الهيدروجيني. يكتشف المستشعر الأيوني تغيرات الأس الهيدروجيني ويحول الإشارات الكيميائية إلى إشارات رقمية ، مما يحقق التسلسل عن طريق التوليف. هذه التقنية لها متطلبات عينة منخفضة ، وعملية بسيطة ، وتكلفة منخفضة ، وسرعة تسلسل سريعة ، وهو أمر مفيد لتوجيه العلاج الكيميائي الفردي بواسطة SNPs.

Introduction

سرطان المعدة هو عبء ثقيل في مجال الصحة العامة العالمية. وفقا لإحصاءات السرطان العالمية لعام 2020 ، التي نشرتها الوكالة الدولية لبحوث السرطان (IARC) ، فإن سرطان المعدة هو خامس أكثر أنواع السرطان تشخيصا ورابع سبب رئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان. وفي جميع أنحاء العالم، فإن معدل معدل التوحيد العمري في شرق آسيا هو الأعلى في كل من الذكور والإناث1. حدوث سرطان المعدة غدرا ، مما يعني أن المرضى في كثير من الأحيان ليس لديهم أي أعراض واضحة ومحددة في المرحلة المبكرة. من بين جميع مرضى سرطان المعدة ، في البلدان التي لا يوجد بها فحص روتيني ، يتم تشخيص 80٪ -90٪ من المرضى في مرحلة متقدمة عندما لا يمكن إجراء عملية جراحية للورم أو الانتكاس في غضون 5 سنوات بعد العملية2.

بالنسبة لسرطان المعدة المتقدم أو النقيلي ، فإن العلاج الكيميائي هو العلاج الرئيسي ، والذي يمكن أن يحسن معدل البقاء على قيد الحياة ونوعية حياة المرضى. بالنسبة للعلاج الأولي للمرضى الذين يعانون من سرطان المعدة النقيلي ، فإن نظام البلاتين فلوروبيريميدين هو الخيار الرئيسي لنظام العلاج الكيميائي من الخط الأول3. يشمل الفلوروبيريميدين بشكل أساسي 5-فلورويوراسيل (5-FU) ومشتقات الفلوروبيريميدين الفموية ، مثل capecitabine و tegafur. الهدف الرئيسي من 5-FU هو الإنزيمات المرتبطة بالتمثيل الغذائي لحمض الفوليك ، والتي تمنع تخليق الحمض النووي وتبطئ نمو أنسجة الورم. تحد التفاعلات الدوائية الضارة من فائدتها ، مع الإسهال والتهاب الغشاء المخاطي وكبت النخاع ومتلازمة اليد والقدم من بين الآثار الجانبية الأكثر شيوعا. تم الإبلاغ عن أن الاستجابة العلاجية والتفاعلات الدوائية الضارة ترتبط ارتباطا وثيقا بعوامل في مسار التمثيل الغذائي لحمض الفوليك. والجدير بالذكر أنه تم تحديد الطفرة المتماثلة الزيجوت ل rs1801131 كمؤشر لمتلازمة اليد والقدم (p = 4.1 × 10-6 ، أو = 9.99 ، 95٪ CI: 3.84-27.8)4. على الرغم من أن الفلوروبيريميدين يستخدم على نطاق واسع في العلاج الكيميائي المضاد للسرطان ، إلا أن مقاومته الكيميائية هي حالة طارئة شائعة ، مما يتسبب في فشل علاجي في علاج سرطان المعدة. على سبيل المثال ، معدل الاستجابة الإجمالي هو 10٪ -15٪ فقط بين المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم المتقدم الذين عولجوا ب 5-FU5 فقط. أيضا ، الفلوروبيريميدين لها سمية لا يمكن تجاهلها. تشمل تفاعلات السمية التي يسببها 5-FU بشكل أساسي الإسهال ، ومتلازمة اليد والقدم ، والتهاب الفم ، وقلة العدلات ، ونقص الصفيحات ، والسمية العصبية ، وحتى الموت6. تحدث السمية الشديدة المرتبطة بالعلاج في 10٪ -30٪ من المرضى الذين عولجوا بالفلوروبيريميدين ، وتحدث السمية القاتلة في 0.5٪ -1٪ من هؤلاء المرضى7.

وجدت دراسة نوعية الحياة للمرضى الذين يعانون من سرطان المعدة المتقدم أن معدل الاستجابة كان أقل من 50٪ لأولئك الذين تلقوا العلاج الكيميائي القائم على 5-FU8. لذلك ، فإن فهم العوامل المتعلقة بحساسية العلاج الكيميائي القائم على 5-FU مهم بشكل خاص للعلاج الدقيق لزيادة معدل الاستجابة والفعالية مع تقليل السمية. بالنظر إلى أن 5-FU يرتبط ارتباطا وثيقا باستقلاب حمض الفوليك ، فقد تكون المتغيرات الجينية للإنزيمات في مسار التمثيل الغذائي لحمض الفوليك أحد العوامل. يعزى حوالي 90٪ من تباين التسلسل البشري إلى طفرات قاعدة واحدة في الحمض النووي ، والمعروفة باسم تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs)9. عندما تغير SNPs خصائص إنزيم استقلاب حمض الفوليك ، فقد يؤدي ذلك إلى اختلافات فردية في الفعالية والسمية والمقاومة الكيميائية للفلورويوراسيل في مرضى سرطان المعدة.

يستخدم اختزال الميثيلين تتراهيدروفولات (MTHFR) بشكل أساسي لتحويل 5،10-ميثيلين تتراهيدروفولات (5،10-MTHF) إلى 5-ميثيل تتراهيدروفولات. 5-FdUMP ، مستقلب 5-FU ، يشكل ثلاثيا غير نشط مع 5،10-MTHF و thymidylate synthase (TS) ، مما يثبط نشاط TS ويؤدي إلى نقص dTMP10. يمكن أن يؤدي تراكم 5،10-MTHF إلى تعزيز تأثير تثبيط 5-FU على TS ، والذي يرتبط بنشاط MTHFR. MTHFR rs1801131 و rs1801133 هما أكثر الأشكال المتعددة شيوعا ، والتي ترتبط بانخفاض نشاط الإنزيم (انخفاض بنسبة 75٪ ل rs1801133 و 30٪ ل rs181131) وتراكم 5,10-MTHF11.

اختزال ثنائي هيدروفولات (DHFR) هو الإنزيم الرئيسي في استقلاب حمض الفوليك وتخليق الحمض النووي. يقلل DHFR من ثنائي هيدروفولات ، باستخدام NADPH ، إلى رباعي هيدروفولات (THF) الذي يستخدم لحمل وحدة الكربون الواحد. SNPs من DHFR قد تؤثر على تعبيره ، وتغيير نشاط ووفرة THF ، وتؤثر كذلك على استقلاب حمض الفوليك وحساسية 5-FU. تحدث طفرة نقطة DHFR rs1650697 في المروج الرئيسي لجين DHFR ، مما يزيد من تعبير DHFR12. وجدت دراسة أن rs442767 يرتبط بفعالية وسمية الأدوية المضادة للأورام المضادة للفولات ، مثل بيميتريكسيد وميثوتريكسات. فيما يتعلق ب SNP rs442767 ، يشير النمط الجيني GT إلى وراثة أليل G وأليل T في نفس الموضع على الكروموسومات المتماثلة من كل والد. وبالمثل ، يشير النمطان الجينيان GG و TT إلى وراثة أليلين G أو أليلين T ، في المقابل. بالمقارنة مع النمط الجيني GT + TT ، يرتبط GG بانخفاض البقاء على قيد الحياة بدون أحداث وزيادة المخاطر13. هذا يشير إلى أن rs442767 قد يؤدي إلى تأثير محتمل معين على 5-FU.

يحفز سينسيز الميثيونين (MTR) إعادة مثيلة الهوموسيستين إلى الميثيونين ، والذي يلعب دورا مهما في استقلاب حمض الفوليك. MTR rs1805087 هو تعدد الأشكال الأكثر شيوعا لجين MTR . MTR rs1805087 يحل محل الجلايسين لحمض الأسبارتيك في الموقع الوظيفي المحتمل للبروتين ، مما قد يقلل من نشاط MTR. الأشخاص الذين لديهم أليل G زادوا من مستوى حمض الفوليك في البلازما وانخفض مستوى الهوموسيستين في البلازما14. على العكس من ذلك ، أظهرت دراسة أن rs1805087 ليس له ارتباط ذي دلالة إحصائية بفعالية 5-FU. لكن هذه الدراسة ركزت على سرطان القولون والمستقيم وكان حجم العينة صغيرا. العلاقة بين rs1805087 وفعالية 5-FU في مرضى سرطان المعدة لا يزال يتعين استكشافها15.

هيدرولاز جاما جلوتاميل (GGH) هو إنزيم ليزوزومي ينظم تركيزات حمض الفوليك داخل الخلايا. حمض Pteroylglutamic هو مرادف لحمض الفوليك الذي يتكون من pterin وحمض p-aminomethylbenzoic وحمض الجلوتاميك. هناك نوعان من حمض الفوليك في الكائنات الحية ، حمض الفوليك أحادي الغلوتامات وحمض الفوليك متعدد الجلوتامات. يتم تحويل THF-polyglutamate إنزيميا إلى حمض الفوليك أحادي الجلوتاميك بواسطة GGH ، مما يؤدي على التوالي إلى إطلاق إما أحادي الغلوتامات (أحادي الجلو) أو ثنائي الغلوتامات (di-Glu) 16. أظهرت دراسة حول تعبير هرمون النمو في المرضى الذين يعانون من سرطان المعدة المتقدم محليا ، أن تعبير هرمون النمو العالي يمكن أن يقلل من 5،10-MTHF و TS ، مما يعني أن هناك حاجة إلى جرعة صغيرة فقط من 5-FU لتحقيق التأثير المثبط TS في هؤلاء المرضى17. GG هو مؤشر حيوي نذير في المرضى الذين يعانون من سرطان المعدة المتقدم محليا والذين عولجوا بالعلاج الكيميائي المساعد بعد العملية الجراحية مع S-1 ، وهو دواء أولي من 5-FU ، ويلعب دورا مهما في الحفاظ على التوازن داخل الخلايا لحمض الفوليك18. GGH rs11545078 هو متغير خاطئ ويغير Thr-127 إلى Ile-127. تشير دراسة تركز على خصوصية الركيزة لهرمون النمو إلى أن rs11545078 ، مقارنة بالنوع البري ، يؤدي إلى ارتفاع Km وانخفاض الكفاءة التحفيزية للميثوتريكسات والهيكل مشابه لحمض الفوليك19. معا ، يعد استكشاف العلاقة بين rs11545078 والنتائج السريرية ل 5-FU استراتيجية واعدة لفهم مقاومة الأدوية.

عائلة حاملة المذاب 19 عضوا 1 (SLC19A1) ، وتسمى أيضا ناقل حمض الفوليك المختزل ، هي بروتين عبر غشائي تيسيري نموذجي يستورد حمض الفوليك المختزل الذي تفتقر خلايا الثدييات إلى القدرة على توليفه من جديد ، والذي يعرف بتقدير استجابة الورم ل 5-FU20. ومع ذلك ، تم إجراء عدد قليل فقط من الدراسات فيما يتعلق بالعلاقة بين 5-FU و SLC19A1 تعدد الأشكال21. في المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة الذين يتلقون بيميتريكسيد وهو نظير حمض الفوليك ، ساهم rs1051298 على الجين SLC19A1 في زيادة خطر حدوث جميع التفاعلات الدوائية الضارة وتقليل البقاء على قيد الحياة بشكل عام22,23. SLC19A1 rs1051298 ، متغير منطقة 3’غير مترجم حول استقلاب حمض الفوليك ، قد يساعد في تفسير بعض الاختلافات الفردية حول العلاج 5-FU. الهدف هنا هو تقييم العلاقة بين مقاومة rs1051298 و 5-FU بين مرضى سرطان المعدة.

يتم استخدام مجموعة ، بناء على تسلسل أشباه الموصلات ، للكشف النوعي عن الجينات في المختبر (الشكل 1) ، والتي يمكنها اكتشاف 7 SNPs مختارة في 5 جينات ، طفرات rs1801131 و rs1801133 لجين MTHFR ، طفرات rs1650697 و rs442767 لجين DHFR ، طفرة rs1805087 لجين MTR ، طفرة rs11545078 لجين GGH و rs1051298 من SLC19A1 الجينات في عينات الأنسجة السرطانية لمرضى سرطان المعدة. أولا ، تم استخراج عينة الحمض النووي ، وتم تضخيم الجزء المستهدف على وجه التحديد بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تمت إضافة محول تسلسل عالمي في طرفي جزء الحمض النووي لإنشاء مكتبة يمكن استخدامها للتسلسل. ثم تم تضخيم مكتبة التسلسل بواسطة PCR لتشكيل قالب تسلسل. تم إثراء النموذج الإيجابي لتلبية متطلبات التسلسل. باستخدام نظام تسلسل أشباه الموصلات ، عن طريق تثبيت شريط الحمض النووي في الفتحة الصغيرة لرقاقة أشباه الموصلات. يأخذ إنزيم بلمرة الحمض النووي (DNA) الحمض النووي (DNA) أحادي الشريط باعتباره القالب، ويخلق شريط الحمض النووي المتكامل وفقا لمبدأ تزاوج القواعد المتكاملة. في كل مرة تمتد فيها قاعدة في سلسلة الحمض النووي (DNA)، ينطلق بروتون، وهو ما يتسبب في تغيرات موضعية في الأس الهيدروجيني. يكتشف المستشعر الأيوني تغيرات الأس الهيدروجيني ويحول الإشارات الكيميائية إلى إشارات رقمية ، بحيث يمكن تفسير القواعد في الوقت الفعلي ، وأخيرا يمكن الحصول على التسلسل الأساسي لكل جزء من الحمض النووي. تم استخدام تحليل المعلوماتية الحيوية لمطابقة هذه التسلسلات مع الخريطة المرجعية للجينوم البشري. عندما تتحور الجينات المرتبطة بسرطان المعدة ، ستتغير تسلسلات قواعد الحمض النووي المقابلة لها ، وذلك للحصول على معلومات الطفرة للجينات ذات الصلة.

يمكن أن تعرض النتيجة حالة الطفرة الجينية وتوفر مرجعا للأطباء لتحديد الأنواع والجرعات المناسبة من أدوية العلاج الكيميائي والتنبؤ بمقاومة الأدوية لمرضى سرطان المعدة. ومع ذلك ، فإن نتائج الاختبار هي فقط للإشارة السريرية ولا ينصح بأن تكون الأساس الوحيد للعلاج الفردي للمرضى. يجب على الأطباء إصدار حكم شامل بناء على حالة المريض ومؤشرات الدواء وردود الفعل العلاجية ومؤشرات الاختبارات المعملية الأخرى.

Protocol

تمت مراجعة جميع البروتوكولات وعينات الأنسجة لسرطان المعدة (الخطوة 1) ، التي تم الحصول عليها من تنظير الجهاز الهضمي العلوي أو الجراحة ، المستخدمة في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في 24 يوليو 2023 (NFEC-2023-298). إلى جانب ذلك ، تم تصميم هذا البروتوكول حصريا لتوضيح الكشف عن الجينات المتعددة في سرطان المعدة دون الانخراط في مقارنات الأتراب ، وبالتالي فهو لا يفرض معايير محددة لإدراج أو استبعاد المرضى. قدم المرضى / المشاركون موافقتهم الخطية المستنيرة للمشاركة في هذه الدراسة. 1. إعداد كتل جزءا لا يتجزأ من سرطان المعدة قم بتكوين نظام تضمين الأنسجة ، الذي يتألف من خزان وموزع البارافين ، جنبا إلى جنب مع الألواح الدافئة والباردة ، باتباع الإرشادات التشغيلية المقررة. استخرج المنديل المحضر لتضمينه من المجفف وقم بإيداعه في فتحة تخزين مركز التضمين. حدد قوالب التضمين المناسبة بناء على حجم الأنسجة ، واسكب كمية كافية من البارافين المذاب لتغطية الأنسجة ، ثم ضع القالب على اللوحة الدافئة. استرجع الأنسجة من الكاسيتات وضع الغشاء المخاطي في المعدة عموديا على قاعدة قالب التضمين للتأكد من أن المستوى المستعرض يخترق جميع طبقات الأنسجة. محاذاة الأنسجة في القالب. ضع الكاسيت في الجزء العلوي من القالب ، متبوعا بصب ثانوي من البارافين ، وملء القالب. ضع القالب المدمج على اللوحة الباردة ، وبعد تصلب البارافين ، قم بإزالة الكتل المدمجة من القوالب. 2. استخراج الحمض النووي من العينات استخدم مجموعات استخراج الحمض النووي وتنقيته لاستخراج الأحماض النووية من عينات الأنسجة المضمنة في البارافين. استخدم محددا كميا للحمض النووي لتحديد كمية الحمض النووي المستخرج. يوصى بأن يكون تركيز الحمض النووي أكبر من 2 نانوغرام / ميكرولتر.ملاحظة: المواد المستخدمة هنا متوفرة في جدول المواد. 3. التحضير لمكتبة التسلسل التحضير قبل التجربةقم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية في طاولة العمل فائقة النظافة ، وقم بتعقيمه لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أطفئ مصباح الأشعة فوق البنفسجية وقم بتشغيل المروحة للتهوية لمدة 10 دقائق. أخرج الحمض النووي من الثلاجة -20 ± 5 درجة مئوية ، وتحقق من معرف العينة والرمز الشريطي للحمض النووي ورقم علامة الملصق المحدد المخصص للعينة وسجله. ضعه على رف أنبوب الطرد المركزي للذوبان في درجة حرارة الغرفة (RT) بعد التحقق ، وقم بطرده لمدة 10 ثوان ، مع 2500 × جم ثابتة للاستعداد. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للجزء المستهدفخذ محلول تفاعل التقاط الشظايا ، والتمهيدي للتضخيم لسرطان المعدة والتمهيدي لتضخيم الانصهار من مجموعة الكشف عن المفاصل متعددة الجينات لسرطان المعدة حسب الطلب وضعها على الجليد للذوبان. رجها واخلطها بعد الذوبان ، وقم بطردها لمدة 10 ثوان ، وقم بإعداد ماء خال من النيوكلياز. يتم عرض معلومات أولية مفصلة في الجدول 1.ملاحظة: المجموعة غير متوفرة تجاريا بعد ، اتصل بالمؤلفين لمزيد من التفاصيل. قم بإعداد أنبوب تفاعل PCR سعة 0.2 مل ، وأضف الكواشف إلى الأنبوب بدوره وفقا للجدول التكميلي 1 ، دوامة واخلطها لمدة 5 ثوان ، وطرد مركزي على الفور لمدة 10 ثوان ، مع 2500 × جم ثابتة ، بحيث لا توجد قطرات واضحة على جدار الأنبوب وغطاءه. يجب نسخ عينات الحمض النووي الريبي عكسيا إلى cDNA ثم استخدامها لبناء المكتبة اللاحقة. تضاف منتجات cDNA إلى الأنابيب بدورها وفقا للجدول التكميلي 2. ضع كل أنبوب تفاعل على جهاز التدوير الحراري. بالنسبة لعينات الحمض النووي ، قم بتشغيل برنامج التضخيم كما هو مفصل في الجدول 2. بالنسبة لمنتجات cDNA ، قم بتشغيل برنامج التضخيم كما هو مفصل في الجدول 3. هضم تسلسل التمهيديأخرج إنزيم الهضم التمهيدي وضعه على الثلج للذوبان. بعد التضخيم ، أخرج أنابيب التفاعل المذكورة أعلاه ، وأضف 2 ميكرولتر من إنزيم الهضم التمهيدي إلى كل أنبوب ، وتأكد من أن الحجم الإجمالي هو 22 ميكرولتر. دوامة وخلط محلول التفاعل في أنبوب PCR وأجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة 10 ثوان ، مع 2500 × غرام ثابتة. ضع كل أنبوب تفاعل على جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل البرنامج كما هو مفصل في الجدول 4. ربط المحولضع الكواشف التي تربط المحول على الجليد ليذوب. قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، ثم امزج كل مكون وفقا للجدول 5 ، وقم بتمييزه على أنه خليط محول X.ملاحظة: تشتمل كواشف توصيل المحول على محولات P1 ومحولات محددة X ، مرقمة من 1 إلى 48. تم تصميم هذه لوضع علامات فريدة على عينات مختلفة. عند إضافة محول معين ، افتح أنبوبا واحدا فقط في كل مرة لمنع التلوث المتبادل للمحول المحدد. يمكن تخزين خليط المحول المحدد المخفف في -20 ± 5 درجة مئوية للاستعداد. في تسلسل سير العمل ، لا تتم معالجة العينات بشكل فردي ، بدلا من ذلك ، يتم دمج عينات متعددة ، كل منها موسوم بمحول معين ، في مكتبة موحدة ، للتسلسل. تتيح هذه الطريقة التمايز اللاحق للعينات بناء على تسلسلات المحول الخاصة بها. أخرج المنتج التمهيدي المهضوم (22 ميكرولتر) من جهاز التدوير الحراري. أضف الكواشف إلى الأنبوب بدوره وفقا للجدول 6 ، دوامة واخلطها لمدة 5 ثوان. أجهزة طرد مركزي بسرعة منخفضة لمدة 10 ثوان ، مع 2500 × جم ثابتة ، بحيث لا يوجد انخفاض واضح على الحائط وغطاء الأنبوب. ضع أنبوب التفاعل على جهاز التدوير الحراري. بالنسبة لعينات الحمض النووي ، قم بتشغيل برنامج التضخيم كما هو مفصل في الجدول 7. بالنسبة لمنتجات cDNA ، قم بتشغيل برنامج التضخيم كما هو مفصل في الجدول 8. تنقية منتج الربط والتضخيمأخرج الحبيبات المغناطيسية لتنقية الحمض النووي من الثلاجة التي تبلغ درجة حرارتها 2-8 درجة مئوية مسبقا ، وقم بتدويرها بالتساوي وطردها مركزيا على الفور لمدة 10 ثوان ، مع 2500 × جم ثابتة. قم بموازنة الحبيبات المغناطيسية في RT لمدة 30 دقيقة. قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الامتزاز سعة 1.5 مل ونقل منتج تفاعل الربط إلى الأنبوب المقابل. أضف 45 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المنقاة من الحمض النووي في كل أنبوب ، دوامة واخلطها جيدا ، وطرد مركزي على الفور لمدة 10 ثوان ، واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة 3 دقائق. تخلص من المادة الطافية وتجنب سحب الخرز. نقل 300 ميكرولتر من الإيثانول 75٪ المعد حديثا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، وتدوير الأنابيب برفق 4x عند 180 درجة. بعد أن يصبح الحل واضحا ، تخلص بسرعة من المادة الطافية. تجنب سحب الخرز للخارج. كرر إجراء الغسيل 1x أكثر. قم بإزالة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل من رف المغناطيس ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (10 ثوان ، مع 2500 × جرام ثابتة). ضع الأنابيب مرة أخرى في رف المغناطيس وأخرج الماصة السائل المتبقي. تأكد من عدم وجود سائل متبقي على جدار الأنبوب. افتح غطاء كل أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل وجفف الخرزات في RT لمدة 5 دقائق. انتبه إلى الحالة الجافة الرطبة للخرز. بعد تجفيف الخرزات المغناطيسية ، تحقق من عدم وجود بقع ماء على السطح. قم بتمديد وقت التجفيف بشكل مناسب إذا كانت الحبيبات المغناطيسية مبللة جدا. أغلق الغطاء على الفور في حالة ظهور أي شقوق على الخرزات وتابع الخطوة التالية لتضخيم المكتبة وتنقيتها. تضخيم وتنقية المكتبةضع الكواشف المتعلقة بتفاعل البوليميراز المتسلسل على الجليد للذوبان مقدما ، وقم بدوامها ، وطردها مركزيا لمدة 10 ثوان. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل من رف المغناطيس ، وماصة حكام PCR في الأنبوب وفقا للجدول 9 وأغلق الغطاء والدوامة لمدة 5 ثوان. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (10 ثوان) للحصول على قطرة سائلة واضحة على جدار الأنبوب والغطاء. انقل المنتج أعلاه إلى أنبوب PCR جديد. احتضان العينة على دراجة حرارية. بالنسبة لعينات الحمض النووي ، قم بتشغيل برنامج التضخيم كما هو مفصل في الجدول 10. بالنسبة لمنتجات cDNA ، قم بتشغيل برنامج التضخيم كما هو مفصل في الجدول 11. قم بإعداد أنبوب طرد مركزي صغير جديد منخفض الامتزاز سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي أنبوب PCR لمدة 10 ثوان بعد الحضانة. انقل المنتج من أنبوب PCR إلى أنبوب EP. أضف 25 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المنقى للحمض النووي في كل أنبوب. دوامة وتخلط جيدا ، وأجهزة الطرد المركزي بسرعة منخفضة واحتضان في RT لمدة 5 دقائق. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة 3 دقائق وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا. نقل الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة. تجنب سحب الخرز للخارج. أضف 60 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المنقى من الحمض النووي في كل أنبوب. دوامة وتخلط جيدا ، وأجهزة الطرد المركزي بسرعة منخفضة واحتضان في RT لمدة 5 دقائق. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة 3 دقائق وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا. تخلص من المادة الطافية. تجنب سحب الخرز للخارج. انقل 300 ميكرولتر من الإيثانول 75٪ المعد حديثا إلى الأنابيب ، وقم بتدوير الأنابيب برفق 4x عند 180 درجة. بعد أن يصبح الحل واضحا ، ماصة بسرعة وتجاهل المادة الطافية. تجنب سحب الخرز للخارج. كرر إجراء الغسيل 1x. قم بإزالة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل من الرف المغناطيسي ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (10 ثوان). أدخل الأنابيب مرة أخرى في الرف المغناطيسي وأخرج السائل المتبقي. تأكد من عدم وجود سائل متبقي على جدار الأنبوب. افتح أغطية أنابيب سعة 1.5 مل وجفف الحبيبات في RT لمدة 5 دقائق. انتبه إلى الحالة الجافة الرطبة للخرز. بعد تجفيف الخرزات المغناطيسية ، لا توجد بقعة ماء على السطح. قم بتمديد وقت التجفيف بشكل مناسب إذا كانت الحبيبات المغناطيسية مبللة جدا. أغلق الغطاء على الفور في حالة ظهور أي تشققات على الخرز. ماصة 50 ميكرولتر من eluent في الأنابيب ، دوامة وتخلط جيدا. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (5 ثوان ، مع 2500 × جم ثابتة) ووضع الأنابيب في RT لمدة 5 دقائق. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة 3 دقائق وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا. قم بإزالة السائل بعناية في أنبوب جديد وحدد اسم المكتبة. قم بتخزين المكتبة في الثلاجة على حرارة 2-8 درجة مئوية مؤقتا وانتظر التحديد الكمي أو قم بتخزين المكتبة في الثلاجة عند -20 ± 5 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. 4. القياس الكمي للمكتبة المبنية استخدم محدد كمية الحمض النووي لتحديد المكتبة. إذا كان تركيز المكتبة ≥ 0.2 نانوغرام / ميكرولتر ، فهو مؤهل. وإلا، فأعد إنشاء المكتبة. امزج حجما متساويا من الحمض النووي (أو الحمض النووي الريبي) وحدد المحلول. وفقا للنتيجة الكمية ، قم بتخفيف المحلول المختلط إلى 100 pmol / L باستخدام الصيغة التالية.ملاحظة: البديل هو تخفيف المكتبة إلى 100 pmol / L وفقا للصيغة ، ثم القياس الكمي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري. امزج مكتبات الحمض النووي (أو الحمض النووي الريبي) بالتساوي وفقا للنتائج الكمية لجهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل. امزج 100 pmol / L مكتبة الحمض النووي ومكتبة الحمض النووي الريبي بنسبة 4: 1. استخدم المحلول المختلط لمكتبة DNA و RNA لتسلسل الكمبيوتر. 5. التسلسل قم بإجراء التسلسل بالرجوع إلى دليل المجموعة العالمية لتفاعل التسلسل24,25 (طريقة تسلسل أشباه الموصلات). 6. مراقبة جودة العينات مراقبة الجودة الإيجابية للحمض النووي لسرطان المعدة: خذ السيطرة الإيجابية على الحمض النووي لسرطان المعدة وقم بإجراء الاختبار وفقا لتعليمات المجموعة. يتم توفير التحكم مع المجموعة. تظهر النتيجة أنه تم الكشف عن طفرات جينية MTHFR و DHFR و MTR و GGH و SLC19A1 . مراقبة الجودة السلبية للحمض النووي لسرطان المعدة: خذ السيطرة السلبية على الحمض النووي لسرطان المعدة وقم بإجراء الاختبار وفقا لتعليمات المجموعة. يتم توفير التحكم مع المجموعة. تظهر النتائج أنه تم اكتشاف الأنواع البرية من جينات MTHFR و DHFR و MTR و GGH و SLC19A1 .ملاحظة: تأكد من استيفاء المعايير في كلتا الحالتين ، وإلا ، يلزم إعادة الكشف. 7. تحليل البيانات قم بتشغيل المكون الإضافي المقابل (المتصل المتغير وتحليل التغطية وبرنامج Ion Reporter) في برنامج Torrent Suite للحصول على نتائج تحليل العينات. احكم على نتائج اكتشاف العينة وفقا لنتائج تحليل المكون الإضافي.

Representative Results

يعتمد تحديد نتائج الاختبار على قيمة الحكم الإيجابي ، والتي يتم التعرف عليها أيضا على أنها الفاصل المرجعي. استخدام طريقة تسلسل أشباه الموصلات للكشف عن العينات السريرية التي تم جمعها. عندما تكون قيمة تردد الطفرة لجينات MTHFR و DHFR و MTR و GGH و SLC19A1 ≥ 5٪ ، تكون نتيجة الكشف هي طفرة الجين المقابل. عندما تكون قيمة تردد الطفرة < 5٪ ، تكون نتيجة الكشف هي النوع البري للجينالمقابل 26. يمكن استخدام المعايير التالية لتحديد ما إذا كانت نتائج الكشف ذات مصداقية. أولا ، إذا كان متوسط تغطية نتائج تسلسل الحمض النووي ≥ 500 ، وكانت القراءات المعينة لنتائج تسلسل الحمض النووي الريبي ≥ 20000 ، فإن نتائج الاختبار موثوقة27. خلاف ذلك ، فمن المستحسن إعادة الاختبار. ثانيا ، يبلغ متوسط تغطية مراقبة جودة الحمض النووي الإيجابي لسرطان المعدة ≥ 500 ، ويجب أن تتوافق نتيجة الاختبار مع طفرات rs1801131 و rs1801133 لجين MTHFR ، وطفرات rs1650697 و rs442767 لجين DHFR ، وطفرة rs1805087 لجين MTR ، وطفرة rs11545078 لجين GGH وطفرة rs1051298 لجين SLC19A1 الجين إيجابي. خلاف ذلك ، فمن المستحسن إعادة الاختبار. ثالثا ، يبلغ متوسط تغطية مراقبة جودة الحمض النووي السلبية لسرطان المعدة ≥ 500 ، ويجب أن تظهر نتائج الكشف أن جميع المواقع ضمن نطاق الكشف عن هذه المجموعة هي من النوع البري. خلاف ذلك ، فمن المستحسن إعادة الاختبار. أخيرا ، تركيز المكتبة أقل من 0.2 نانوغرام / ميكرولتر ، والذي قد يكون بسبب تدهور الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي في العينة ، أو الفشل في اتباع العملية التجريبية بدقة أو استخدام الكواشف منتهية الصلاحية أثناء التجربة. قد تتسبب الشروط المذكورة أعلاه في انخفاض جودة التسلسل أو فشلها. يوصى بإعادة بناء المكتبة. باستخدام هذه المجموعة ، يتم اتباع سلسلة من الخطوات لبناء مكتبة تسلسل من العينات السريرية. ثم يتم تسلسل المكتبة على منصة تسلسل أشباه الموصلات الأيونية ، مع استخدام ANNOVAR لشرح النتائج. بعد التسلسل ، يتم استخدام مستند لتلخيص أنواع الطفرات لكل عينة. يشير عدم وجود نوع متحور إلى أن العينة لم تخضع لتلك الطفرة المحددة. ويقدم الجدول التكميلي3 مثالا نموذجيا على ذلك. يتضمن الجدول 12 معلومات أساسية حول SNPs المكتشفة هنا. تحليل كل SNPs باستخدام التعليقات التوضيحية المستندة إلى التصفية في قواعد بيانات مختلفة ، مثل مشروع 1000 Genomes (1000g2015aug ؛ https://www.internationalgenome.org/; الجدول 13) واتحاد تجميع الإكسوم (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; الجدول 14) ، يمكن أن يكشف أن SNPs المختلفة موجودة بشكل كبير في مجموعات سكانية مختلفة. الشكل 1: مخطط التدفق للبروتوكول. مخطط انسيابي للكشف عن الجينات المتعددة لسرطان المعدة باستخدام طريقة تسلسل أشباه الموصلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. صبغي مكان الفاصل الزمني لتصميم التمهيدي التمهيدي الأيسر التمهيدي الأيمن CHR1 11854475 CHR1: 11854175-11854775 ACAGGATGGGGAAGTCACAG اGGTCACAAAG 11856377 CHR1: 11856077-11856677 CTTCAGGTCAGCCTCAAAGC TCCCTGTGGTCTCTTCATCC الفصل 5 79950780 CHR5: 79950480-79951080 CGCCGCACATAGTAGGTTCT CTTCCTCCTCCAGCCCTATC 79951495 CHR5: 79951195-79951795 CTTGGGTCACCTGCACAGTA أتغاجACCCAAGCTG CHR1 237048499 CHR1: 237048199-237048799 GTCAAAGGCCAGTCCCTTCT CTCCCTTCACCAACTGTGCT الفصل 8 63938763 chr8: 63938463-63939063 CAGTGAAGTTكاججكات TATTTTCCTGTGTGGGGCAC الفصل 21 46934825 chr21: 46934525-46935125 CCAACCTGAGATGGCTTTTC TCCTTGGTGCTCTTGCTTTT الجدول 1: البادئات المستخدمة ل SNPs السبعة المختارة في خمسة جينات. تعرض هذه الورقة معلومات حول موقع البادئات من SNPs المرتبطة بمقاومة 5-FU في سرطان المعدة. درجة الحرارة الوقت لا. عدد الدورات 99 درجة مئوية 2 دقيقة 1 دورة 99 درجة مئوية 15 ثانية 22 دورة 60 درجة مئوية 4 دقائق 10 درجة مئوية مسك 1 دورة الجدول 2: برنامج الدورة الحرارية لتضخيم الحمض النووي. توضح ظروف التفاعل الحراري مثل درجة الحرارة والزمن والدورات. درج درجة الحرارة الوقت لا. عدد الدورات تنشيط الانزيمات 99 درجة مئوية 2 دقيقة 1 دورة تشويه 99 درجة مئوية 15 ثانية 30 دورة صلب وتمديد 60 درجة مئوية 4 دقائق احتفظ 10 درجة مئوية مسك 1 دورة الجدول 3: برنامج الدورة الحرارية لتضخيم cDNA. توضح ظروف التفاعل الحراري مثل درجة الحرارة والزمن والدورات. درجة الحرارة الوقت لا. عدد الدورات 50 درجة مئوية 10 دقائق 1 دورة 55 درجة مئوية 10 دقائق 1 دورة 60 درجة مئوية 20 دقيقة 1 دورة 10 درجة مئوية مسك 1 دورة الجدول 4: برنامج الدورة الحرارية لهضم تسلسل التمهيدي. يتم عرض ظروف التفاعلات الحرارية مثل درجة الحرارة والوقت والدورات. مكون حجم محول P1 1.5 ميكرولتر محول معين X 1.5 ميكرولتر ماء خال من النيوكلياز 3 ميكرولتر الحجم الكلي لنظام التفاعل 6 ميكرولتر X: يشير إلى رقم المحول المحدد الجدول 5: تسلسل إضافة الكواشف لتحضير خليط المحول. أضف الكواشف إلى الأنبوب بالترتيب الموضح هنا. مكون حجم توصيل المخزن المؤقت 4 ميكرولتر محول خليط X 2 ميكرولتر ربط الحمض النووي 2 ميكرولتر الحجم الكلي لنظام التفاعل 30 ميكرولتر الجدول 6: تسلسل إضافة الكواشف إلى إنتاج التمهيدي المهضوم. أضف الكواشف إلى الأنبوب بالترتيب الموضح هنا. درجة الحرارة الوقت لا. عدد الدورات 22 درجة مئوية 30 دقيقة 1 دورة 72 درجة مئوية 10 دقائق 1 دورة 10 درجة مئوية مسك 1 دورة الجدول 7: برنامج الدورة الحرارية لتوصيل المحول بالحمض النووي. يتم عرض ظروف التفاعلات الحرارية مثل درجة الحرارة والوقت والدورات. درجة الحرارة الوقت لا. عدد الدورات 22 درجة مئوية 30 دقيقة 1 دورة 68 درجة مئوية 5 دقائق 1 دورة 72 درجة مئوية 5 دقائق 1 دورة 10 درجة مئوية مسك 1 دورة الجدول 8: برنامج الدورة الحرارية لتوصيل المحول بالحمض النووي cDNA. يتم عرض ظروف التفاعلات الحرارية مثل درجة الحرارة والوقت والدورات. مكون حجم حل رد فعل تضخيم المكتبة 50 ميكرولتر خليط مكتبة التمهيدي 2 ميكرولتر الحجم الكلي لنظام التفاعل 52 ميكرولتر الجدول 9: تسلسل إضافة كواشف التضخيم. أضف الكواشف إلى الأنبوب بالترتيب الموضح هنا. درجة الحرارة الوقت لا. عدد الدورات 98 درجة مئوية 2 دقيقة 1 دورة 98 درجة مئوية 15 ثانية 5 دورات 60 درجة مئوية 1 دقيقة 10 درجة مئوية مسك 1 دورة الجدول 10: برنامج الدورة الحرارية لتضخيم مكتبة الحمض النووي. يتم عرض ظروف التفاعلات الحرارية مثل درجة الحرارة والوقت والدورات. درجة الحرارة الوقت لا. عدد الدورات 98 درجة مئوية 2 دقيقة 1 دورة 98 درجة مئوية 15 ثانية 5 دورات 64 درجة مئوية 1 دقيقة 10 درجة مئوية مسك 1 دورة الجدول 11: برنامج الدورة الحرارية لتضخيم مكتبة cDNA. يتم عرض ظروف التفاعلات الحرارية مثل درجة الحرارة والوقت والدورات. RS1801131 RS1801133 RS1650697 RS442767 RS1805087 rs11545078 RS1051298 الرقم المرجعي T G A G A G G بديل G A G T G A A Func.refGeneWithVer إكسونيك إكسونيك يو تي آر 5 المنبع إكسونيك إكسونيك UTR3 Gene.refGeneWithVer مثفر مثفر دففر دففر متر جي جي إتش SLC19A1 جينات التفاصيل.refGeneWithVer . . NG_023304.1:ز.5020 ت > ز . . . NM_001205206.1:ج.*64ج>ت;NM_001205207.1:ج.*746ج>ت;NM_194255.2:ج.* 746C>T إكسونيكفونك.refGeneWithVer غير مترادف.إس إن في غير مترادف.إس إن في . . غير مترادف.إس إن في غير مترادف.إس إن في . AAChange.refGeneWithVer مثفر:NM_001330358.1:EXOn8: c.A1409C: ص.E470A ؛ مثفر:NM_005957.4:إكسون 8: c.A1286ج: p.E429A مثفر:NM_001330358.1:EXOn5: c.C788T: ص.أ 263 فولت ؛ مثفر:نM_005957.4:exon5: c.C665T:ص.A222V . . MTR:NM_001291939.1: إكسون 25: c.A2603G: ص.D868G ؛ MTR:NM_001291940.1: إكسون 25: ج.أ1535G: p.D512G ؛MTR:NM_000254.2: إكسون 26: ج.A2756G: p.D919 جي هرمون النمو: NM_003878.2: إكسون 5: c.C452T:ص.ت151ط جين سيتوباند 1ص36.22 1ص36.22 5Q14.1 5Q14.1 1Q43 8q12.3 21q22.3 الجدول 12: المعلومات ذات الصلة ب SNPs. شرح العينات باستخدام ANNOVAR. مثفر دففر متر جي جي إتش SLC19A1 RS1801131 RS1801133 RS1650697 RS442767 RS1805087 rs11545078 RS1051298 1000g2015aug_all 0.249401 0.245407 0.76857 0.290136 0.218251 0.085463 0.524361 1000g2015aug_afr 0.1513 0.09 0.9349 0.0318 0.2844 0.056 0.5772 1000g2015aug_amr 0.1513 0.4741 0.755 0.3991 0.1772 0.0403 0.4323 1000g2015aug_eas 0.2192 0.2956 0.6607 0.5853 0.1052 0.0873 0.5635 1000g2015aug_eur 0.3131 0.3648 0.7555 0.3191 0.173 0.0924 0.4493 1000g2015aug_sas 0.4172 0.1186 0.6779 0.228 0.3211 0.1483 0.5552 الجدول 13: التعليق التوضيحي القائم على المرشح ل SNPs في مشروع 1000 جينوم. مثفر دففر متر جي جي إتش SLC19A1 RS1801131 RS1801133 RS1650697 RS442767 RS1805087 rs11545078 RS1051298 ExAC_ALL 0.295 0.3037 . . 0.2091 0.0936 . ExAC_AFR 0.1588 0.1124 . . 0.2666 0.0545 . ExAC_AMR 0.1555 0.5141 . . 0.1864 0.0361 . ExAC_EAS 0.2148 0.3052 . . 0.1132 0.0824 . ExAC_FIN 0.3128 0.2227 . . 0.1892 0.0581 . ExAC_NFE 0.3191 0.345 . . 0.1919 0.0969 . ExAC_OTH 0.304 0.3062 . . 0.2108 0.0973 . ExAC_SAS 0.4153 0.1409 . . 0.316 0.165 . الجدول 14: التعليق التوضيحي القائم على المرشح ل SNPs في اتحاد تجميع Exome. الجدول التكميلي 1: تسلسل إضافة الكواشف لتضخيم الحمض النووي. أضف الكواشف إلى الأنبوب بالترتيب الموضح هنا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الجدول التكميلي 2: تسلسل إضافة الكواشف لتضخيم cDNA. أضف الكواشف إلى الأنبوب بالترتيب الموضح هنا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف. الجدول التكميلي 3: مثال على نتائج تسلسل العينات السريرية. سيتم تسجيل الطفرات الموجودة في العينات فقط في الوثائق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يتفق الخبراء السريريون بالإجماع على أن المرضى ، حتى مع نفس النوع والمرحلة من سرطان المعدة ، يمكن أن يكون لديهم استجابات مختلفة بشكل ملحوظ لنهج العلاج المتطابق. كشفت سنوات من البحث للعلماء أن الاختلافات الفردية تعزى بشكل رئيسي إلى طبيعة سرطان المعدة كمجموعة خلوية غير متجانسة ومتعددة الأشكال ومتنوعة ، مما يؤدي إلى تفاوتات فردية كبيرة في استجابات العلاج28. وبالتالي ، فإن الحصول على عينات سرطان المعدة من خلال التنظير الهضمي العلوي أو الجراحة وعينات الدم ، إلى جانب التسلسل عالي الإنتاجية للتحليل الجيني ، يتيح علاجا شخصيا لسرطان المعدة. تم تصميم هذه الاستراتيجية لتعزيز فعالية العلاج السريري وتقليل مخاطر الآثار الجانبية السامة الشديدة. أدى التقدم في تقنية تسلسل أشباه الموصلات الأيونية إلى تحويل العلاج الشخصي إلى واقع عملي29.

فيما يلي بعض القيود على طريقة الاختبار هذه. المجموعة المستخدمة هنا مخصصة بشكل أساسي للتشخيص في المختبر ، لذلك فهي تقتصر على اكتشاف طفرة rs1801131 و rs1801133 لجين MTHFR و rs1650697 و rs442767 من جين DHFR ، rs1805087 من جين MTR ، rs11545078 من جين GGH و rs1051298 من SLC19A1. لا يمكن اكتشاف طفرة في أقسام أخرى. بسبب عدم التجانس الكبير في أنسجة الورم ، قد تؤثر مواقع أخذ العينات المختلفة على نتائج الكشف. بالنسبة لعينات الأنسجة المدمجة في البارافين المخزنة لمدة أطول ، قد يتحلل الحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى حد ما ، مما يؤثر على نتائج الاختبار. قد يؤدي جمع العينات ونقلها ومعالجتها بشكل غير معقول ، بالإضافة إلى التشغيل التجريبي غير السليم والبيئة التجريبية إلى نتائج سلبية أو إيجابية خاطئة. لا يمكن ضمان نتيجة الكشف إذا كان تركيز الحمض النووي أقل من 2 نانوغرام / ميكرولتر. نتائج اختبار المجموعة هي فقط للإشارة السريرية. يجب النظر في اختيار العلاج الشخصي للمرضى بالاقتران مع أعراضهم / علاماتهم وتاريخهم الطبي والاختبارات المعملية الأخرى وردود الفعل العلاجية. لا يمكن للنتائج السلبية أن تستبعد تماما وجود طفرة جينية مستهدفة. يمكن أن تحدث النتائج السلبية أيضا بسبب عدد قليل جدا من الخلايا السرطانية في العينة ، أو التدهور المفرط للحمض النووي أو تركيز الجين المستهدف في نظام تفاعل التضخيم أقل من حد الكشف.

بعض مؤشرات الأداء للمجموعة المستخدمة كما هو موضح. الحساسية التحليلية: بالنسبة لعينات الحمض النووي ، فإن الحد الأدنى للكمية التي يمكن اكتشافها من إجمالي الحمض النووي في هذه المجموعة هو 10 نانوغرام ، ويمكن اكتشاف معدل طفرة بنسبة 5٪. بالنسبة لعينات الحمض النووي الريبي ، فإن الحد الأدنى للكمية التي يمكن اكتشافها من إجمالي الحمض النووي في هذه المجموعة هو 10 نانوغرام. معدل المصادفة الإيجابية والسلبية: تصل نسبة المصادفة الإيجابية والسلبية إلى 100٪. حد الكشف (LOD): يمكن استخدام ما مجموعه 14 مرجعا LOD ، مرقمة L1-L14. L1-L11 هي مراجع LOD لجينات MTHFR و DHFR و MTR و GGH و SLC19A1 ، ويجب أن تكون نتائج اكتشافها أن أنواع الطفرات لمواقع الجينات المقابلة إيجابية ، ومعدلات المصادفة 100٪. التكرار: يمكن استخدام ما مجموعه خمس مواد مرجعية متكررة ، مرقمة R1-R5. R1 هي مادة مرجعية متكررة إيجابية قوية (طفرة rs67376798 لجين DPYD ). R2 ، الذي يحتوي على هذه الطفرة بعدد أقل ، هو مادة مرجعية متكررة إيجابية ضعيفة (طفرة rs67376798 لجين DPYD ) ، R3 هي مادة مرجعية سلبية متكررة (تم الكشف عن 6 مواقع من جينات DPYD و MTHFR و ABCB1 كنوع بري). يجب اختبار كل عينة مرجعية 10 مرات ، مما يضمن أن نتائج هذه التقييمات المتكررة تتوافق مع تصنيفاتها المحددة مسبقا. حجم البيانات: يجب التحكم في حجم البيانات الفعال لعينات الحمض النووي والحمض النووي الريبي فوق 0.05 متر. يجب التحكم في عمق تسلسل عينات الحمض النووي فوق 500 ، ويجب التحكم في القراءات المعينة لعينات الحمض النووي الريبي فوق 20000. اختبار التداخل: لا تتأثر هذه المجموعة بمواد التداخل الداخلية (الدهون الثلاثية والألبومين) ومواد التداخل الخارجية (الفورمالين والكحول المجفف).

يجب مراعاة بعض الاحتياطات أثناء التجربة. لا يمكن استخدام المجموعة المستخدمة هنا إلا للاختبار في المختبر. يرجى قراءة هذا الدليل بعناية قبل التجربة واستخدامه خلال فترة الصلاحية. لا يمكن استخدام مكونات المجموعة على دفعات مختلفة بالتبادل. يوصى باستخدام المواد الاستهلاكية التي تستخدم لمرة واحدة لهذه المجموعة لمنع التلوث. أثناء استخدام هذه المجموعة ، يوصى باستخدام رأس شفط مع عنصر مرشح. من أجل تجنب أي مخاطر بيولوجية محتملة في العينة ، يجب اعتبار عينة الاختبار مواد معدية لتجنب ملامسة الجلد والأغشية المخاطية. يوصى بالتعامل مع العينات في خزانة السلامة البيولوجية التي يمكن أن تمنع تدفق الهباء الجوي. يجب تعقيم أنابيب الاختبار والمصاصين المستخدمين في العملية قبل التخلص منها. يجب أن يفي تشغيل العينات والتخلص منها بمتطلبات القوانين واللوائح ذات الصلة: المبادئ التوجيهية العامة للسلامة البيولوجية للمختبرات الطبية الحيوية الميكروبية ولوائح إدارة النفايات الطبية لوزارة الصحة30,31. يجب أن يتلقى الموظفون التجريبيون تدريبا مهنيا ، وأن يعملوا بما يتفق بدقة مع التعليمات ، وأن يفصلوا المناطق بدقة وفقا للعملية التجريبية. يجب استخدام أدوات ومعدات خاصة في كل مرحلة من مراحل العملية التجريبية ، ويجب عدم استخدام المواد في كل مرحلة من كل منطقة بالتبادل. يجب على الموظفين التجريبيين فصل المناطق بدقة وفقا للعملية التجريبية. يجب استخدام أدوات ومعدات خاصة في كل مرحلة من مراحل العملية التجريبية. اتخذ تدابير وقائية كما هو مطلوب ، مثل القفازات وملابس العمل وما إلى ذلك. يجب أن يمتثل التخلص من النفايات للوائح الوطنية ذات الصلة.

على الرغم من أن تركيز هذه المقالة ينصب على SNPs السبعة ضمن خمسة جينات مرتبطة بسرطان المعدة ، إلا أن التسلسل في التطبيقات العملية لا يقتصر على هذه الجينات الخمسة وحدها. تثبت هذه الورقة بشكل قاطع وجود علاقة كبيرة بين SNPs السبعة والحساسية للعلاج الكيميائي 5-FU في سرطان المعدة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذه الدراسة مدعومة باستكشاف آلية ودور مسار ERK2 / Snai1 / AGPS / PUFA-PL في مقاومة خلايا سرطان المعدة لداء الحديديات الناجم عن أباتينيب (رقم الصنف: 82172814) ، بدعم من المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين ؛ التحقيق في دور وآلية عامل نسخ إصبع الزنك 1 في تعديل مقاومة خلايا سرطان المعدة لداء الحديد الناجم عن أباتينيب عبر مسار فوسفوليبيد الأثير غير المشبع (رقم الصنف: 2022A1515010267) ، بدعم من لجنة مقاطعة قوانغدونغ لتمويل البحوث الأساسية والتطبيقية ؛ والبحث وتطبيق الكاشف لتشخيص الحساسية الكيميائية 5-FU لسرطان المعدة (رقم الصنف: 201903010072) ، مشاريع العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو.

Materials

1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
Amplification primer of gastric cancer Thermo Fisher The primers are sythesized by Thermo Fshier according to the sequence in Table 1.
Deparaffinization Qiagen 19093
DNA purification magnetic beads Bechkman A63881
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent
Factory Thermo Fisher Scientific		 http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher 4480441
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Pipette tips  Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
PureLink RNA Mini Columns Thermo Fisher A29839
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit Thermo Fisher AM1975
Tabletop mini centrifuge SCILOGES S1010E
Thermal Cycler Life Technologies 4375786
Ultramicro nucleic acid analyzer BEIJING ORIENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT LTD. BD-1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8, (2017).
  3. Shah, M. A., et al. Immunotherapy and targeted therapy for advanced gastroesophageal cancer: Asco guideline. J Clin Oncol. 41 (7), 1470-1491 (2023).
  4. Loganayagam, A., et al. Pharmacogenetic variants in the dpyd, tyms, cda and mthfr genes are clinically significant predictors of fluoropyrimidine toxicity. Br J Cancer. 108 (12), 2505-2515 (2013).
  5. Giacchetti, S., et al. Phase iii multicenter randomized trial of oxaliplatin added to chronomodulated fluorouracil-leucovorin as first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 18 (1), 136-147 (2000).
  6. Hoff, P. M., et al. Comparison of oral capecitabine versus intravenous fluorouracil plus leucovorin as first-line treatment in 605 patients with metastatic colorectal cancer: Results of a randomized phase iii study. J Clin Oncol. 19 (8), 2282-2292 (2001).
  7. Meulendijks, D., et al. Clinical relevance of dpyd variants c.1679t>g, c.1236g>a/hapb3, and c.1601g>a as predictors of severe fluoropyrimidine-associated toxicity: A systematic review and meta-analysis of individual patient data. Lancet Oncol. 16 (16), 1639-1650 (2015).
  8. Sadighi, S., Mohagheghi, M. A., Montazeri, A., Sadighi, Z. Quality of life in patients with advanced gastric cancer: A randomized trial comparing docetaxel, cisplatin, 5-fu (tcf) with epirubicin, cisplatin, 5-fu (ecf). BMC Cancer. 6, 274 (2006).
  9. Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
  10. Ladner, R. D. The role of dutpase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy. Curr Protein Pept Sci. 2 (4), 361-370 (2001).
  11. Capitain, O., et al. The influence of fluorouracil outcome parameters on tolerance and efficacy in patients with advanced colorectal cancer. Pharmacogenomics J. 8 (4), 256-267 (2008).
  12. Askari, B. S., Krajinovic, M. Dihydrofolate reductase gene variations in susceptibility to disease and treatment outcomes. Curr Genomics. 11 (8), 578-583 (2010).
  13. Ceppi, F., et al. DNA variants in dhfr gene and response to treatment in children with childhood b all: Revisited in aieop-bfm protocol. Pharmacogenomics. 19 (2), 105-112 (2018).
  14. Sharp, L., Little, J. Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and colorectal neoplasia: A huge review. Am J Epidemiol. 159 (5), 423-443 (2004).
  15. Yousef, A. M., et al. The association of polymorphisms in folate-metabolizing genes with response to adjuvant chemotherapy of colorectal cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 82 (2), 237-243 (2018).
  16. Schneider, E., Ryan, T. J. Gamma-glutamyl hydrolase and drug resistance. Clin Chim Acta. 374 (1-2), 25-32 (2006).
  17. Moran, R. G. Roles of folylpoly-gamma-glutamate synthetase in therapeutics with tetrahydrofolate antimetabolites: An overview. Semin Oncol. 26 (2), 24-32 (1999).
  18. Maezawa, Y., et al. High gamma-glutamyl hydrolase and low folylpolyglutamate synthetase expression as prognostic biomarkers in patients with locally advanced gastric cancer who were administrated postoperative adjuvant chemotherapy with s-1. J Cancer Res Clin Oncol. 146 (1), 75-86 (2020).
  19. Cheng, Q., et al. A substrate specific functional polymorphism of human gamma-glutamyl hydrolase alters catalytic activity and methotrexate polyglutamate accumulation in acute lymphoblastic leukaemia cells. Pharmacogenetics. 14 (8), 557-567 (2004).
  20. Zhang, Q., et al. Recognition of cyclic dinucleotides and folates by human slc19a1. Nature. 612 (7938), 170-176 (2022).
  21. Ulrich, C. M., et al. Polymorphisms in folate-metabolizing enzymes and response to 5-fluorouracil among patients with stage ii or iii rectal cancer (int-0144; swog 9304). Cancer. 120 (21), 3329-3337 (2014).
  22. Zhang, X., et al. Discovery of novel biomarkers of therapeutic responses in han chinese pemetrexed-based treated advanced nsclc patients. Front Pharmacol. 10, 944 (2019).
  23. Corrigan, A., et al. Pharmacogenetics of pemetrexed combination therapy in lung cancer: Pathway analysis reveals novel toxicity associations. Pharmacogenomics J. 14 (5), 411-417 (2014).
  24. Ion 520 & ion 530 ext kit – chef user guide. Thermofisherscientific Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf (2023)
  25. Ion genestudio s5 instrument user guide. Thermofisherscientific Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf (2023)
  26. Parkin, N. T., et al. Multi-laboratory comparison of next-generation to sanger-based sequencing for hiv-1 drug resistance genotyping. Viruses. 12 (7), 694 (2020).
  27. Ziller, M. J., Hansen, K. D., Meissner, A., Aryee, M. J. Coverage recommendations for methylation analysis by whole-genome bisulfite sequencing. Nat Methods. 12 (3), 230-232 (2015).
  28. Lordick, F., et al. Unmet needs and challenges in gastric cancer: The way forward. Cancer Treat Rev. 40 (6), 692-700 (2014).
  29. Kumar, K. R., Cowley, M. J., Davis, R. L. Next-generation sequencing and emerging technologies. Semin Thromb Hemost. 45 (7), 661-673 (2019).
  30. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. Ministry of Health of the People’s Republic of China. WS 233-2002. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. , 1-64 (2002).
  31. China Environmental Protection Industry. Medical waste management regulations. China Environmental Protection Industry. (1), 6-10 (2004).

Tags

Gastric CancerSingle Nucleotide PolymorphismsSNPs5-fluorouracil5-FUPharmacogeneticsMTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1Ion Semiconductor SequencingNext-generation Sequencing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, K., Yan, X., Huang, Z., Liang, H., Li, Z., Wang, M., Wan, Y., Wang, S., Zhao, L. Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (207), e66058, doi:10.3791/66058 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image