JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Detectie van multi-gen single nucleotide polymorfisme bij maagkanker op basis van Ion Semiconductor Sequencing Platform

Published: May 10, 2024
doi:
10.3791/66058
, , , , , , , ,
1Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2Research and Development Department,Guangzhou Darui Biotechnology Co., Ltd, 3Key Laboratory of Antibody Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University, 4Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy,Southern Medical University

Summary

Dit protocol stelt holistische laboratoriumprocedures voor die nodig zijn om single nucleotide polymorfismen te detecteren in maagkankermonsters op basis van een ionenhalfgeleidersequencingplatform. De doelsequenties, ligatieadapters, bibliotheekversterking en -zuivering en kwaliteitscontrolecriteria worden ook in detail beschreven.

Abstract

Maagkanker is een veel voorkomende heterogene tumor. De meeste patiënten hebben op het moment van de diagnose gevorderde maagkanker en hebben vaak chemotherapie nodig. Hoewel 5-fluorouracil (5-FU) veel wordt gebruikt voor de behandeling, moeten de therapeutische gevoeligheid en geneesmiddeltolerantie nog worden bepaald, wat het belang van geïndividualiseerde toediening benadrukt. Farmacogenetica kan de klinische implementatie van geïndividualiseerde behandeling begeleiden. Single nucleotide polymorfismen (SNP’s), als genetische marker, dragen bij aan de selectie van geschikte chemotherapieregimes en doseringen. Sommige SNP’s worden in verband gebracht met het foliumzuurmetabolisme, het therapeutische doelwit van 5-FU. Methyleentetrahydrofolaatreductase (MTHFR) rs1801131 en rs1801133, dihydrofolaatreductase (DHFR) rs1650697 en rs442767, methioninesynthase (MTR) rs1805087, gamma-glutamylhydrolase (GGH) rs11545078 en opgeloste stofdragerfamilie 19 lid 1 (SLC19A1) rs1051298 zijn onderzocht bij verschillende soorten kanker en antifolaatantitumorgeneesmiddelen, die een potentiële voorspellende en sturende betekenis hebben voor toepassing van 5-FU. De ionenstroom van de volgende generatie halfgeleidersequencingtechnologie kan snel maagkankergerelateerde SNP’s detecteren. Elke keer dat een base in een DNA-keten wordt verlengd, komt er een H+ vrij, waardoor lokale pH-veranderingen ontstaan. De ionische sensor detecteert pH-veranderingen en zet chemische signalen om in digitale signalen, waardoor sequencing door synthese wordt bereikt. Deze techniek heeft een lage monstervereiste, eenvoudige bediening, lage kosten en een hoge sequencingsnelheid, wat gunstig is voor het begeleiden van geïndividualiseerde chemotherapie door SNP’s.

Introduction

Maagkanker is een zware last op het gebied van de wereldwijde volksgezondheid. Volgens de Global Cancer Statistics 2020, gepubliceerd door het International Agency for Research on Cancer (IARC), is maagkanker de vijfde meest gediagnosticeerde kanker en de vierde belangrijkste doodsoorzaak door kanker. Wereldwijd is de incidentie van leeftijdsgestandaardiseerde cijfers in Oost-Azië het hoogst bij zowel mannen als vrouwen1. Het optreden van maagkanker is verraderlijk, wat betekent dat patiënten in een vroeg stadium vaak geen duidelijke en specifieke symptomen hebben. Van alle maagkankerpatiënten, in landen zonder routinematige screening, wordt 80%-90% van de patiënten in een vergevorderd stadium gediagnosticeerd wanneer de tumor niet kan worden geopereerd of terugvalt binnen 5 jaar na de operatie2.

Voor gevorderde of gemetastaseerde maagkanker is chemotherapie de belangrijkste behandeling, die de overlevingskans en kwaliteit van leven van patiënten kan verbeteren. Voor de initiële behandeling van patiënten met gemetastaseerde maagkanker is een platina-fluoropyrimidineregime de belangrijkste keuze voor een eerstelijns chemotherapeutischregime. Fluoropyrimidine omvat voornamelijk 5-fluorouracil (5-FU) en orale fluoropyrimidinederivaten, zoals capecitabine en tegafur. Het belangrijkste doelwit van 5-FU zijn foliumzuurmetabolisme-gerelateerde enzymen, die de DNA-synthese remmen en de groei van tumorweefsel vertragen. Bijwerkingen beperken hun bruikbaarheid, waarbij diarree, mucositis, myelosuppressie en hand-voetsyndroom tot de meest voorkomende bijwerkingen behoren. Er is gemeld dat therapeutische respons en bijwerkingen nauw verband houden met factoren in de foliumzuurmetabole route. Met name de homozygote mutatie van rs1801131 is geïdentificeerd als een indicator voor hand-voetsyndroom (p = 4,1 x 10-6, OR = 9,99, 95% BI: 3,84-27,8)4. Hoewel fluoropyrimidines op grote schaal worden gebruikt bij chemotherapie tegen kanker, is hun chemoresistentie een veel voorkomende noodsituatie, die therapeutisch falen veroorzaakt bij de behandeling van maagkanker. Het totale responspercentage is bijvoorbeeld slechts 10%-15% bij patiënten met gevorderde colorectale kanker die worden behandeld met 5-FU slechts5. Ook hebben fluoropyrimidines een toxiciteit die niet kan worden genegeerd. De toxiciteitsreacties die door 5-FU worden geïnduceerd, omvatten voornamelijk diarree, hand-voetsyndroom, stomatitis, neutropenie, trombocytopenie, neurotoxiciteit en zelfs de dood6. Ernstige behandelingsgerelateerde toxiciteit treedt op bij 10%-30% van de patiënten die worden behandeld met fluoropyrimidines, en fatale toxiciteit treedt op bij 0,5%-1% van deze patiënten7.

Uit een onderzoek naar de kwaliteit van leven van patiënten met gevorderde maagkanker bleek dat het responspercentage minder dan 50% was voor degenen die chemotherapie op basis van 5-FU kregen8. Daarom is het begrijpen van de factoren die verband houden met de gevoeligheid van chemotherapie op basis van 5-FU bijzonder belangrijk voor een nauwkeurige behandeling om het responspercentage en de effectiviteit te maximaliseren en tegelijkertijd de toxiciteit te minimaliseren. Gezien het feit dat 5-FU nauw verwant is aan het foliumzuurmetabolisme, kunnen de genetische varianten van enzymen in de foliumzuurmetabole route een van de factoren zijn. Ongeveer 90% van de menselijke sequentievariatie wordt toegeschreven aan mutaties in één base in DNA, bekend als single nucleotide polymorfismen (SNP’s)9. Wanneer SNP’s de enzymeigenschappen van het foliumzuurmetabolisme veranderen, kan dit leiden tot individuele verschillen in werkzaamheid, toxiciteit en chemoresistentie tegen fluorouracil bij maagkankerpatiënten.

Methyleentetrahydrofolaatreductase (MTHFR) wordt voornamelijk gebruikt om 5,10-methyleentetrahydrofolaat (5,10-MTHF) om te zetten in 5-methyltetrahydrofolaat. 5-FdUMP, een metaboliet van 5-FU, vormt inactief ternair met 5,10-MTHF en thymidylaatsynthase (TS), waardoor de activiteit van TS wordt geremd en een tekort aan dTMP10 ontstaat. Accumulatie van 5,10-MTHF kan het remmingseffect van 5-FU op TS versterken, wat gecorreleerd is met de activiteit van MTHFR. MTHFR rs1801131 en rs1801133 zijn de meest voorkomende polymorfismen, die verband houden met een lagere enzymactiviteit (een afname van 75% voor rs1801133 en 30% voor rs181131) en accumulatie van 5,10-MTHF11.

Dihydrofolaatreductase (DHFR) is het belangrijkste enzym in het foliumzuurmetabolisme en de DNA-synthese. DHFR reduceert dihydrofolaat, met behulp van NADPH, tot tetrahydrofolaat (THF) dat wordt gebruikt om een eenheid van één koolstof te vervoeren. SNP’s van DHFR kunnen de expressie ervan beïnvloeden, de activiteit en overvloed van THF veranderen en het foliumzuurmetabolisme en de gevoeligheid van 5-FU verder beïnvloeden. DHFR rs1650697 puntmutatie treedt op in de belangrijkste promotor van het DHFR-gen, wat de DHFR-expressie verhoogt12. Uit een studie bleek dat rs442767 in verband wordt gebracht met de werkzaamheid en toxiciteit van antifolaatantitumorgeneesmiddelen, zoals pemetrexed en methotrexaat. Met betrekking tot de SNP rs442767 betekent een GT-genotype de overerving van een G-allel en een T-allel op dezelfde locus op de homologe chromosomen van elke ouder. Evenzo duiden de genotypen GG en TT de overerving van twee G-allelen of twee T-allelen aan. Vergeleken met genotype GT+TT is GG gerelateerd aan verminderde gebeurtenisvrije overleving en verhoogd risico13. Dit suggereert dat rs442767 kan leiden tot een bepaalde potentiële invloed op 5-FU.

Methioninesynthase (MTR) katalyseert de remethylering van homocysteïne tot methionine, dat een belangrijke rol speelt in het foliumzuurmetabolisme. MTR rs1805087 is het meest voorkomende polymorfisme van het MTR-gen . MTR rs1805087 vervangt glycine door asparaginezuur op de potentieel functionele plaats van eiwit, wat de activiteit van MTR kan verminderen. Proefpersonen met het G-allel hadden een verhoogd foliumzuurgehalte in het plasma en een verlaagd homocysteïnegehalte in het plasma14. Integendeel, een studie toonde aan dat rs1805087 geen statistisch significant verband heeft met de werkzaamheid van 5-FU. Maar deze studie richtte zich op colorectale kanker en de steekproefomvang was klein. De relatie tussen rs1805087 en de werkzaamheid van 5-FU bij maagkankerpatiënten moet nog worden onderzocht15.

Gamma-glutamylhydrolase (GGH) is een lysosomaal enzym dat de intracellulaire foliumzuurconcentraties reguleert. Pteroylglutaminezuur is het synoniem van foliumzuur dat bestaat uit pterine, p-aminomethylbenzoëzuur en glutaminezuur. Er zijn twee vormen van foliumzuur in organismen, monoglutamaat foliumzuur en polyglutamine foliumzuur. THF-polyglutamaat wordt enzymatisch omgezet in monoglutaminefoliumzuur door GGH, waarbij achtereenvolgens monoglutamaat (mono-Glu) of di-glutamaat (di-Glu) vrijkomt16. Een onderzoek naar GGH-expressie bij patiënten met lokaal gevorderde maagkanker toonde aan dat een hoge GGH-expressie 5,10-MTHF en TS kon verminderen, wat betekent dat slechts een kleine dosering van 5-FU nodig is om het TS-remmende effect bij deze patiënten te bereiken17. GG is een prognostische biomarker bij patiënten met lokaal gevorderde maagkanker die worden behandeld met postoperatieve adjuvante chemotherapie met S-1, een prodrug van 5-FU, en speelt een belangrijke rol bij het handhaven van intracellulaire homeostase van foliumzuur18. GGH rs11545078 is een missense-variant en verandert Thr-127 in Ile-127. Een studie die zich richt op de substraatspecificiteit van GGH suggereert dat rs11545078, vergeleken met wildtype, resulteert in een hogere km en een lagere katalytische efficiëntie voor methotrexaat en dat de structuur vergelijkbaar is met foliumzuur19. Samen is het onderzoeken van de relatie tussen rs11545078 en klinische resultaten van 5-FU een veelbelovende strategie om resistentie tegen geneesmiddelen te begrijpen.

Opgeloste stof dragerfamilie 19 lid 1 (SLC19A1), ook wel gereduceerde foliumzuurtransporter genoemd, is een typisch faciliterend transmembraaneiwit dat gereduceerde folaten importeert die zoogdiercellen niet de novo kunnen synthetiseren, wat wordt erkend om de respons van de tumor op 5-FU20 te schatten. Er zijn echter slechts enkele onderzoeken uitgevoerd naar de associatie tussen 5-FU en SLC19A1 polymorfisme21. Bij patiënten met niet-kleincellige longkanker die pemetrexed kregen, een foliumzuuranaloog, droeg de rs1051298 op het SLC19A1-gen bij aan het verhogen van het risico op alle bijwerkingen van geneesmiddelen en het verminderen van de algehele overleving22,23. SLC19A1 rs1051298, een 3′-onvertaalde regiovariant over foliumzuurmetabolisme, kan helpen bij het verklaren van enkele van de individuele verschillen over 5-FU-therapie. Hier is het doel om de associatie tussen rs1051298 en 5-FU-resistentie bij patiënten met maagkanker te evalueren.

Een kit, gebaseerd op halfgeleidersequencing, wordt gebruikt voor kwalitatieve gendetectie in vitro (Figuur 1), die 7 geselecteerde SNP’s in 5 genen kan detecteren, de rs1801131- en rs1801133-mutaties van het MTHFR-gen , rs1650697 en rs442767-mutaties van het DHFR-gen , rs1805087-mutatie van het MTR-gen , rs11545078-mutatie van het GGH-gen en rs1051298 van SLC19A1 gen in tumorweefselmonsters van maagkankerpatiënten. Eerst werd het nucleïnezuur van het monster geëxtraheerd en werd het doelfragment specifiek geamplificeerd door PCR. Aan beide uiteinden van het DNA-fragment is een universele sequencing-adapter toegevoegd om een bibliotheek te construeren die kan worden gebruikt voor sequencing. Vervolgens werd de sequencingbibliotheek versterkt door PCR om een sequencing-sjabloon te vormen. Het positieve sjabloon is verrijkt om aan de sequentie-eisen te voldoen. Met behulp van het halfgeleidersequencingsysteem, door de DNA-streng in het kleine gaatje van de halfgeleiderchip te bevestigen. DNA-polymerase neemt het enkelstrengs DNA als sjabloon en synthetiseert de complementaire DNA-streng volgens het principe van complementaire basenparen. Elke keer dat een base in een DNA-keten wordt verlengd, komt er een proton vrij, waardoor lokale pH-veranderingen ontstaan. Een ionische sensor detecteert pH-veranderingen en zet chemische signalen om in digitale signalen, zodat basen in realtime kunnen worden geïnterpreteerd en uiteindelijk de basensequentie van elk DNA-segment kan worden verkregen. Bioinformatica-analyse werd gebruikt om deze sequenties te matchen met de referentiekaart van het menselijk genoom. Wanneer maagkankergerelateerde genen muteren, zullen hun overeenkomstige DNA-basensequenties veranderen, om de mutatie-informatie van verwante genen te verkrijgen.

Het resultaat kan de status van genmutatie weergeven en een referentie zijn voor clinici om de juiste typen en doseringen van chemotherapiegeneesmiddelen te selecteren en de resistentie tegen geneesmiddelen tegen maagkanker te voorspellen. De testresultaten zijn echter alleen voor klinische referentie en worden niet aanbevolen als de enige basis voor geïndividualiseerde behandeling van patiënten. Clinici moeten een uitgebreid oordeel vellen op basis van de toestand van de patiënt, geneesmiddelindicaties, behandelingsreacties en andere laboratoriumtestindicatoren.

Protocol

Alle protocollen en de weefselmonsters van maagkanker (stap 1), verkregen uit endoscopie of chirurgie van het bovenste deel van het maagdarmkanaal, die in deze studie zijn gebruikt, zijn op 24 juli 2023 beoordeeld en goedgekeurd door de medisch-ethische commissie (NFEC-2023-298). Bovendien is dit protocol uitsluitend ontworpen om de detectie van meerdere genen bij maagkanker te illustreren zonder cohortvergelijkingen uit te voeren, daarom legt het geen specifieke criteria op voor het opnemen of uitsluiten van patiënten. De patiënten/deelnemers gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek. 1. Bereiding van ingebedde blokken maagkanker Configureer het weefselinbeddingssysteem, bestaande uit een paraffinereservoir en dispenser, naast warme en koude platen, volgens de voorgeschreven operationele richtlijnen. Haal het voorbereide weefsel voor inbedding uit de dehydrator en deponeer het in de opberggleuf van het inbeddingscentrum. Selecteer passende inbeddingsmallen op basis van de weefselgrootte, giet voldoende gesmolten paraffine om het weefsel te bedekken en plaats de mal vervolgens op de warme plaat. Haal het weefsel uit de cassettes en plaats het maagslijmvlies loodrecht op de basis van de inbeddingsmal om ervoor te zorgen dat de dwarsdoorsnede door alle weefsellagen snijdt. Lijn het weefsel in de mal uit. Plaats de cassette op de bovenkant van de vorm, gevolgd door een secundaire gieting van paraffine en vul de vorm. Plaats de ingebedde vorm op de koude plaat en breek na het stollen van de paraffine de ingebedde blokken van de vormen af. 2. Extractie van nucleïnezuur uit monsters Gebruik nucleïnezuurextractie- en zuiveringskits om nucleïnezuren te extraheren uit in paraffine ingebedde weefselmonsters. Gebruik een nucleïnezuurkwantificator om het geëxtraheerde nucleïnezuur te kwantificeren. De nucleïnezuurconcentratie wordt aanbevolen om hoger te zijn dan 2 ng/μL.OPMERKING: De hier gebruikte materialen zijn beschikbaar in de Tabel met materialen. 3. Voorbereiding voor sequencing-bibliotheek Voorbereiding voor het experimentZet de UV-lamp in de ultraschone werkbank AAN, steriliseer gedurende 30 minuten. Zet vervolgens de UV-lamp UIT en zet de ventilator AAN om gedurende 10 minuten te ventileren. Haal het nucleïnezuur uit de koelkast -20 ± 5 °C, controleer en noteer de monster-ID, de nucleïnezuurbarcode en het specifieke labeltagnummer dat aan het monster is toegewezen. Plaats het op het centrifugebuisrek om na verificatie op te lossen bij kamertemperatuur (RT) en centrifugeer het gedurende 10 s, met een vaste 2.500 x g voor stand-by. PCR-amplificatie van doelfragmentNeem de reactieoplossing voor het vastleggen van fragmenten, de amplificatieprimer van maagkanker en de fusie-amplificatieprimer uit de op maat gemaakte multi-gen-gewrichtsdetectiekit voor maagkanker en leg ze op ijs om te smelten. Schud en meng ze na het smelten, centrifugeer ze gedurende 10 s en bereid nucleasevrij water. Gedetailleerde informatie over de primer wordt weergegeven in tabel 1.OPMERKING: De kit is nog niet in de handel verkrijgbaar, neem contact op met authotrs voor meer informatie. Bereid een PCR-reactiebuis van 0,2 ml voor, voeg op zijn beurt reagentia toe aan de buis volgens aanvullende tabel 1, draai en meng gedurende 5 s, en centrifugeer onmiddellijk gedurende 10 s, met een vaste 2.500 x g, zodat er geen duidelijke druppels op de buiswand en het deksel zijn. RNA-monsters worden omgekeerd getranscribeerd in cDNA en vervolgens gebruikt voor de daaropvolgende bibliotheekconstructie. cDNA-producten worden achtereenvolgens aan de buisjes toegevoegd overeenkomstig aanvullende tabel 2. Plaats elke reactiebuis op de thermische cycler. Voer voor de DNA-monsters het amplificatieprogramma uit zoals beschreven in tabel 2. Voor cDNA-producten voert u het versterkingsprogramma uit zoals beschreven in Tabel 3. Vertering van de primersequentieHaal het primerverteringsenzym eruit en leg het op ijs om te smelten. Verwijder na amplificatie de bovenstaande reactiebuisjes, voeg 2 μL primervergistingsenzym toe aan elke buis en zorg ervoor dat het totale volume 22 μL is. Draai en meng de reactieoplossing in de PCR-buis en centrifugeer onmiddellijk gedurende 10 s, met een vaste 2.500 x g. Plaats elke reactiebuis op de thermische cycler en voer het programma uit zoals beschreven in Tabel 4. Ligatie van adapterLeg de verbindingsreagentia van de adapter op ijs om op te lossen. Bereid de microcentrifugebuis van 1,5 ml voor en meng vervolgens elk onderdeel volgens tabel 5 en markeer het als adaptermengsel X.OPMERKING: De reagentia voor het aansluiten van de adapter omvatten P1-adapters en specifieke adapters X, genummerd van 1 tot en met 48. Deze zijn ontworpen om verschillende monsters op unieke wijze te taggen. Wanneer u een specifieke adapter toevoegt, open dan slechts één buis tegelijk om kruisbesmetting van de specifieke adapter te voorkomen. Het verdunde specifieke adaptermengsel kan worden opgeslagen bij -20 ± 5 °C voor stand-by. In sequencing-workflows worden samples niet afzonderlijk verwerkt, maar worden meerdere samples, elk getagd met een specifieke adapter, gecombineerd in een uniforme bibliotheek voor sequencing. Deze methode maakt het mogelijk om monsters vervolgens te differentiëren op basis van hun specifieke adaptersequenties. Haal het verteerde primerproduct (22 μL) uit de thermische cycler. Voeg om de beurt reagentia toe aan de buis volgens tabel 6, vortex en meng gedurende 5 s. Centrifugeer op lage snelheid gedurende 10 s, met een vaste 2.500 x g, zodat er geen duidelijke druppel op de wand en het deksel van de buis is. Plaats de reactiebuis op de thermische cycler. Voer voor de DNA-monsters het amplificatieprogramma uit zoals beschreven in tabel 7. Voor cDNA-producten voert u het amplificatieprogramma uit zoals beschreven in Tabel 8. Zuivering van ligatieproduct en amplificatieHaal de magnetische korrels voor DNA-zuivering van tevoren uit de koelkast van 2-8 °C, draai ze gelijkmatig en centrifugeer ze onmiddellijk gedurende 10 s, met een vaste 2.500 x g. Breng de magnetische kralen 30 minuten in evenwicht bij RT. Bereid een microcentrifugebuis met lage adsorptie van 1,5 ml voor en breng het product van de ligatiereactie over naar de overeenkomstige buis. Voeg 45 μL DNA-gezuiverde magnetische kralen toe aan elke buis, draai en meng goed, centrifugeer onmiddellijk gedurende 10 s en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Plaats de buis gedurende 3 minuten op een magnetisch rek. Gooi het supernatans weg en vermijd het pipetteren van de kralen. Breng 300 μL nieuw bereide 75% ethanol over in de microcentrifugebuis en draai de buizen voorzichtig 4x 180°. Nadat de oplossing duidelijk is, gooit u de supernatant snel weg. Vermijd het pipetteren van de kralen. Herhaal de wasprocedure nog 1x meer. Haal de microcentrifugebuisjes van 1,5 ml uit het magneetrek en centrifugeer kort (10 s, met een vaste 2.500 x g). Plaats de buisjes terug in het magneetrek en pipetteer de resterende vloeistof eruit. Zorg ervoor dat er geen restvloeistof op de buiswand achterblijft. Open de dop van elk microcentrifugebuisje van 1,5 ml en droog de korrels 5 minuten bij RT. Let op de droog-nat toestand van de kralen. Nadat de magnetische kralen zijn gedroogd, controleert u of er geen watervlekken op het oppervlak zijn. Verleng de droogtijd op de juiste manier als de magnetische kralen te nat zijn. Sluit het deksel onmiddellijk als er scheuren in de kralen ontstaan en ga verder met de volgende stap om de bibliotheek te versterken en te zuiveren. Versterking en zuivering van de bibliotheekLeg PCR-gerelateerde reagentia van tevoren op ijs om op te lossen, draai ze om en centrifugeer ze gedurende 10 s. Verwijder de microcentrifugebuis van 1.5 ml uit het magneetrek, pipetteer de PCR-regenten in de buis volgens tabel 9 en sluit de dop en de vortex gedurende 5 seconden. Centrifugeer kort (10 s) om geen duidelijke vloeistofdruppel op de buiswand en het deksel te krijgen. Breng het bovenstaande product over in een nieuwe PCR-buis. Incubeer het monster op een thermische cycler. Voer voor de DNA-monsters het amplificatieprogramma uit zoals beschreven in tabel 10. Voor cDNA-producten voert u het amplificatieprogramma uit zoals beschreven in Tabel 11. Bereid een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml met lage adsorptie voor. Centrifugeer de PCR-buis gedurende 10 s na incubatie. Breng het product over van de PCR-buis naar de EP-buis. Voeg 25 μL DNA-gezuiverde magnetische kralen toe aan elke buis. Draai en meng goed, centrifugeer op lage snelheid en incubeer bij RT gedurende 5 minuten. Plaats de buisjes 3 minuten op een magnetisch rek en wacht tot de oplossing helder wordt. Breng het supernatans over in nieuwe microcentrifugebuisjes. Vermijd het pipetteren van de kralen. Voeg 60 μL DNA-gezuiverde magnetische kralen toe aan elke buis. Draai en meng goed, centrifugeer op lage snelheid en incubeer bij RT gedurende 5 minuten. Plaats de buisjes 3 minuten op een magnetisch rek en wacht tot de oplossing helder wordt. Gooi het supernatant weg. Vermijd het pipetteren van de kralen. Breng 300 μL van de nieuw bereide 75% ethanol over in de buizen en draai de buizen voorzichtig 4x 180°. Nadat de oplossing helder is, pipetteert u de supernatant snel en gooit u deze weg. Vermijd het pipetteren van de kralen. Herhaal de wasprocedure 1x. Verwijder de microcentrifugebuisjes van 1,5 ml uit het magnetische rek en centrifugeer kort (10 s). Steek de buisjes terug in het magnetische rek en pipetteer de resterende vloeistof eruit. Zorg ervoor dat er geen restvloeistof op de buiswand achterblijft. Open de doppen van de buisjes van 1,5 ml en droog de kralen 5 minuten bij RT. Let op de droog-nat toestand van de kralen. Nadat de magnetische kralen zijn gedroogd, komt er geen watervlek op het oppervlak. Verleng de droogtijd op de juiste manier als de magnetische kralen te nat zijn. Sluit het deksel onmiddellijk als er scheuren in de kralen ontstaan. Pipette 50 μL eluent in de buisjes, draai en meng goed. Centrifugeer kort (5 s, met een vaste 2.500 x g) en plaats de buisjes gedurende 5 minuten op RT. Plaats de buisjes 3 minuten op een magnetisch rek en wacht tot de oplossing helder wordt. Verwijder de vloeistof voorzichtig in een nieuwe tube en markeer de naam van de bibliotheek. Bewaar de bibliotheek tijdelijk in een koelkast bij 2-8 °C en wacht op kwantitatieve bepaling of bewaar de bibliotheek in een koelkast bij -20 ± 5 °C voor langdurige opslag. 4. Kwantificering van de gebouwde bibliotheek Gebruik de nucleïnezuurkwantificator om de bibliotheek te kwantificeren. Als de bibliotheekconcentratie ≥ 0,2 ng/μL ligt, is deze gekwalificeerd. Anders bouwt u de bibliotheek opnieuw op. Meng een gelijk volume DNA (of RNA) en kwantificeer de oplossing. Verdun de gemengde oplossing volgens het kwantitatieve resultaat tot 100 pmol/L met behulp van de volgende formule.OPMERKING: Een alternatief is om de bibliotheek te verdunnen tot 100 pmol/L volgens de formule en vervolgens te kwantificeren met fluorescerende kwantitatieve PCR. Meng DNA( of RNA) bibliotheken gelijk volgens de kwantitatieve resultaten van het PCR-instrument. Meng 100 pmol/L DNA-bibliotheek en RNA-bibliotheek in een verhouding van 4:1. Gebruik de gemengde oplossing van DNA- en RNA-bibliotheek voor computersequencing. 5. Opeenvolging Voer sequencing uit door de handleiding van de universele kit van sequencingreactie24,25 (halfgeleidersequencingmethode) te raadplegen. 6. Kwaliteitscontrole van monsters Positieve kwaliteitscontrole van maagkanker-DNA: Neem de DNA-positieve controle van maagkanker en voer de test uit volgens de instructies van de kit. De besturing wordt meegeleverd met de kit. Het resultaat laat zien dat MTHFR-, DHFR-, MTR-, GGH- en SLC19A1-genmutanten worden gedetecteerd. Negatieve kwaliteitscontrole van maagkanker-DNA: Neem de DNA-negatieve controle van maagkanker en voer de test uit volgens de instructies van de kit. De besturing wordt meegeleverd met de kit. Het resultaat laat zien dat de wildtypen MTHFR, DHFR, MTR, GGH en SLC19A1 genen worden gedetecteerd.OPMERKING: Zorg ervoor dat in beide gevallen aan de criteria wordt voldaan, anders is herdetectie vereist. 7. Analyse van de gegevens Voer de bijbehorende plug-in (de Variant Caller, Coverage Analysis en Ion Reporter Software) uit in de Torrent Suite-software om de analyseresultaten van de voorbeelden op te halen. Beoordeel de resultaten van de monsterdetectie op basis van de analyseresultaten van de plug-in.

Representative Results

De bepaling van de testresultaten is gebaseerd op de positieve beoordelingswaarde, die ook als referentie-interval wordt erkend. Gebruik de sequencingmethode voor halfgeleiders om de verzamelde klinische monsters te detecteren. Wanneer de mutatiefrequentiewaarde van de genen MTHFR, DHFR, MTR, GGH en SLC19A1 ≥ 5% is, is het detectieresultaat de mutant van het overeenkomstige gen. Wanneer de waarde van de mutatiefrequentie < 5 % ligt, is het detectieresultaat het wildtype van het overeenkomstige gen26. Aan de hand van de volgende criteria kan worden bepaald of de detectieresultaten geloofwaardig zijn. Ten eerste, als de gemiddelde dekking van DNA-sequencingresultaten ≥ 500 ligt en de in kaart gebrachte lezingen van RNA-sequencingresultaten ≥ 20000 liggen, zijn de testresultaten geloofwaardig27. Anders is het aan te raden om opnieuw te testen. Ten tweede is de gemiddelde dekking van DNA-positieve kwaliteitscontrole van maagkanker ≥ 500 en moet het testresultaat voldoen aan de rs1801131- en rs1801133-mutaties van het MTHFR-gen , rs1650697 en rs442767-mutaties van het DHFR-gen , rs1805087-mutatie van het MTR-gen , rs11545078-mutatie van het GGH-gen en rs1051298-mutatie van SLC19A1 gen als positief. Anders is het aan te raden om opnieuw te testen. Ten derde is de gemiddelde dekking van DNA-negatieve kwaliteitscontrole van maagkanker ≥ 500, en de detectieresultaten zouden moeten aantonen dat alle locaties binnen het detectiebereik van deze kit wildtype zijn. Anders is het aan te raden om opnieuw te testen. Ten slotte is de bibliotheekconcentratie lager dan 0,2 ng/μL, wat te wijten kan zijn aan de afbraak van DNA of RNA in het monster, of het niet strikt volgen van het experimentele proces of het gebruik van verlopen reagentia tijdens het experiment. De bovenstaande omstandigheden kunnen ertoe leiden dat de kwaliteit van de sequencing afneemt of uitvalt. Het wordt aanbevolen om de bibliotheek opnieuw op te bouwen. Met deze kit worden een reeks stappen gevolgd om een sequencingbibliotheek op te bouwen op basis van klinische monsters. De bibliotheek wordt vervolgens gesequenced op een ionenhalfgeleider-sequencingplatform, waarbij ANNOVAR wordt gebruikt voor het annoteren van de resultaten. Na sequencing wordt een document gebruikt om de mutanttypen voor elk monster samen te vatten. De afwezigheid van een mutant type gaf aan dat het monster die specifieke mutatie niet onderging. Aanvullendetabel 3 geeft hiervan een typisch voorbeeld. Tabel 12 bevat basisinformatie over de SNP’s die hier zijn gedetecteerd. Analyse van elke SNP met behulp van op filters gebaseerde annotatie in verschillende databases, zoals 1000 Genomes Project (1000g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; Tabel 13) en het Exome Aggregation Consortium (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Tabel 14), kan laten zien dat verschillende SNP’s significant aanwezig zijn in verschillende populaties. Figuur 1: Stroomschema voor het protocol. Stroomdiagram van detectie van meerdere genen voor maagkanker met behulp van halfgeleidersequencing-methode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Chromosoom Plaats Ontwerpinterval voor primer Linker primer Juiste primer chr1 11854475 chr1:11854175-11854775 ACAGGATGGGGAAGTCACAG AAACCGGAATGGTCACAAAG 11856377 chr1:11856077-11856677 CTTCAGGTCAGCCTCAAAGC TCCCTGTGGTCTCTTCATCC chr5 zei: 79950780 chr5:79950480-79951080 CGCCGCACATAGTAGGTTCT CTTCCTCCTCCAGCCCTATC 79951495 chr5:79951195-79951795 CTTGGGTCACCTGCACAGTA ATTTTGAAGCACCCAAGCTG chr1 237048499 CHR1:237048199-237048799 GTCAAAGGCCAGTCCCTTCT CTCCCTTCACCAACTGTGCT chr8 zei: 63938763 chr8:63938463-63939063 CAGTGAAGTTCAGCGGCAT TATTTTCCTGTGTGGGGCAC chr21 zei: 46934825 CHR21:46934525-46935125 CCAACCTGAGATGGCTTTTC TCCTTGGTGCTCTTGCTTTT Tabel 1: Primers gebruikt voor de zeven geselecteerde SNP’s in vijf genen. Dit blad geeft de informatie weer over de locatie van de primers van SNP’s geassocieerd met 5-FU-resistentie bij maagkanker. Temperatuur Tijd Nee. van cycli 99 °C 2 min 1 cyclus 99 °C 15 seconden 22 cycli 60 °C 4 min 10 °C Houden 1 cyclus Tabel 2: Thermische cyclusprogramma voor DNA-amplificatie. Thermische reactieomstandigheden zoals temperatuur, tijd en cycli worden weergegeven. Stap Temperatuur Tijd Nee. van cycli Activeer enzymen 99 °C 2 min 1 cyclus Vernietigen 99 °C 15 seconden 30 cycli Gloeien en verlengen 60 °C 4 min Bewaren 10 °C Houden 1 cyclus Tabel 3: Thermisch cyclusprogramma voor cDNA-amplificatie. Thermische reactieomstandigheden zoals temperatuur, tijd en cycli worden weergegeven. Temperatuur Tijd Nee. van cycli 50 °C 10 minuten 1 cyclus 55 °C 10 minuten 1 cyclus 60 °C 20 minuten 1 cyclus 10 °C Houden 1 cyclus Tabel 4: Thermische cyclusprogramma voor de vertering van de primersequentie. Omstandigheden van thermische reacties, zoals temperatuur, tijd en cycli, worden weergegeven. Bestanddeel Volume P1-adapter 1,5 μL Specifieke adapter X 1,5 μL Nuclease-vrij water 3 μL Totaal volume van het reactiesysteem 6 μL X: Geeft het specifieke adapternummer aan Tabel 5: Volgorde van het toevoegen van reagentia voor de bereiding van het adaptermengsel. Voeg reagentia toe aan de buis in de hier aangegeven volgorde. Bestanddeel Volume Buffer aansluiten 4 μL Adapter mengsel X 2 μL DNA-ligase 2 μL Totaal volume van het reactiesysteem 30 μL Tabel 6: Opeenvolging van toevoeging van reagentia aan de productie van verteerde primers. Voeg reagentia toe aan de buis in de hier aangegeven volgorde. Temperatuur Tijd Nee. van cycli 22 °C 30 minuten 1 cyclus 72 °C 10 minuten 1 cyclus 10 °C Houden 1 cyclus Tabel 7: Thermische cyclusprogramma voor het aansluiten van de adapter op DNA. Omstandigheden van thermische reacties, zoals temperatuur, tijd en cycli, worden weergegeven. Temperatuur Tijd Nee. van cycli 22 °C 30 minuten 1 cyclus 68 °C 5 min 1 cyclus 72 °C 5 min 1 cyclus 10 °C Houden 1 cyclus Tabel 8: Thermische cyclusprogramma voor het aansluiten van de adapter op cDNA. Omstandigheden van thermische reacties, zoals temperatuur, tijd en cycli, worden weergegeven. Bestanddeel Volume Reactieoplossing van bibliotheekversterking 50 μL Library primer mengsel 2 μL Totaal volume van het reactiesysteem 52 μL Tabel 9: Volgorde van het toevoegen van versterkingsreagentia. Voeg reagentia toe aan de buis in de hier aangegeven volgorde. Temperatuur Tijd Nee. van cycli 98 °C 2 min 1 cyclus 98 °C 15 seconden 5 cycli 60 °C 1 minuut 10 °C Houden 1 cyclus Tabel 10: Thermische cyclusprogramma voor het versterken van de DNA-bibliotheek. Omstandigheden van thermische reacties, zoals temperatuur, tijd en cycli, worden weergegeven. Temperatuur Tijd Nee. van cycli 98 °C 2 min 1 cyclus 98 °C 15 seconden 5 cycli 64 °C 1 minuut 10 °C Houden 1 cyclus Tabel 11: Thermische cyclusprogramma voor het versterken van de cDNA-bibliotheek. Omstandigheden van thermische reacties, zoals temperatuur, tijd en cycli, worden weergegeven. RS1801131 NL RS1801133 NL RS1650697 NL € 442767 RS1805087 NL RS11545078 NL RS1051298 NL Ref T G Een G Een G G Alt G Een G T G Een Een Func.refGeneWithVer exonisch exonisch UTR5 stroomopwaarts exonisch exonisch UTR3 Gen.refGeneWithVer MTHFR MTHFR DHFR DHFR MTR GGH SLC19A1 GeneDetail.refGeneWithVer . . NG_023304.1:g.5020T>G . . . NM_001205206.1:c.*64C>T;NM_001205207.1:c.*746C>T;NM_194255.2:c.*746C>T ExonicFunc.refGeneWithVer niet-synoniem;SNV niet-synoniem;SNV . . niet-synoniem;SNV niet-synoniem;SNV . AAChange.refGeneWithVer MTHFR:NM_001330358.1:EXOn8:c.A1409C:blz.E470A; MTHFR:NM_005957.4:exon8:c.A1286C:p.E429A MTHFR:NM_001330358.1:EXOn5:c.C788T:blz.A263V; MTHFR:NM_005957.4:exon5:c.C665T:p.A222V . . MTR:NM_001291939.1:exon25:c.A2603G:blz.D868G; MTR:NM_001291940.1:exon25:c.A1535G: p.D512G;MTR:NM_000254.2:exon26:c.A2756G:p.D919G GGH: NM_003878.2:exon5:c.C452T:P.T151I Jin cytoBand 1p36.22 1p36.22 5Q14.1 5Q14.1 1e kwartaal 43 8Q12.3 21e vraag 222.3 Tabel 12: Relevante informatie van de SNP’s. Annoteren van de monsters met ANNOVAR. MTHFR DHFR MTR GGH SLC19A1 RS1801131 NL RS1801133 NL RS1650697 NL € 442767 RS1805087 NL RS11545078 NL RS1051298 NL 1000g2015aug_all 0.249401 0.245407 0.76857 0.290136 0.218251 0.085463 0.524361 1000g2015aug_afr 0.1513 0.09 0.9349 0.0318 0.2844 0.056 0.5772 1000g2015aug_amr 0.1513 0.4741 0.755 0.3991 0.1772 0.0403 0.4323 1000g2015aug_eas 0.2192 0.2956 0.6607 0.5853 0.1052 0.0873 0.5635 1000g2015aug_eur 0.3131 0.3648 0.7555 0.3191 0.173 0.0924 0.4493 1000g2015aug_sas 0.4172 0.1186 0.6779 0.228 0.3211 0.1483 0.5552 Tabel 13: Filtergebaseerde annotatie van SNP’s in het 1000 Genomes Project. MTHFR DHFR MTR GGH SLC19A1 RS1801131 NL RS1801133 NL RS1650697 NL € 442767 RS1805087 NL RS11545078 NL RS1051298 NL ExAC_ALL 0.295 0.3037 . . 0.2091 0.0936 . ExAC_AFR 0.1588 0.1124 . . 0.2666 0.0545 . ExAC_AMR 0.1555 0.5141 . . 0.1864 0.0361 . ExAC_EAS 0.2148 0.3052 . . 0.1132 0.0824 . ExAC_FIN 0.3128 0.2227 . . 0.1892 0.0581 . ExAC_NFE 0.3191 0.345 . . 0.1919 0.0969 . ExAC_OTH 0.304 0.3062 . . 0.2108 0.0973 . ExAC_SAS 0.4153 0.1409 . . 0.316 0.165 . Tabel 14: Filtergebaseerde annotatie van SNP’s in het Exome Aggregation Consortium. Aanvullende tabel 1: Sequentie van het toevoegen van reagentia voor DNA-amplificatie. Voeg reagentia toe aan de buis in de hier aangegeven volgorde. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende tabel 2: Sequentie van het toevoegen van reagentia voor cDNA-amplificatie. Voeg reagentia toe aan de buis in de hier aangegeven volgorde. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende tabel 3: Voorbeeld van resultaten van de sequentiebepaling van klinische monsters. Alleen mutaties die in de specimens aanwezig zijn, worden in de documenten opgenomen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Klinische experts zijn het er unaniem over eens dat patiënten, zelfs met hetzelfde type en stadium van maagkanker, duidelijk verschillende reacties kunnen hebben op een identieke behandelingsaanpak. Jaren van onderzoek hebben wetenschappers onthuld dat de individuele variaties voornamelijk worden toegeschreven aan de aard van maagkanker als een heterogene, polymorfe en divers gedifferentieerde cellulaire populatie, wat leidt tot aanzienlijke individuele verschillen in behandelingsresponsen28. Bijgevolg maakt het verkrijgen van maagkankermonsters door middel van endoscopie of chirurgie van het bovenste deel van het maagdarmkanaal en bloedmonsters, in combinatie met high-throughput sequencing voor genetische analyse, een gepersonaliseerde behandeling van maagkanker mogelijk. Deze strategie is ontworpen om de werkzaamheid van de klinische behandeling te verbeteren en het risico op ernstige toxische bijwerkingen te verminderen. De vooruitgang in de sequencingtechnologie voor ionenhalfgeleiders heeft van gepersonaliseerde behandeling een praktische realiteit gemaakt29.

Hier zijn enkele beperkingen van deze testmethode. De kit die hier wordt gebruikt, is voornamelijk bedoeld voor in-vitrodiagnose , dus het is beperkt tot het detecteren van de mutatie van rs1801131 en rs1801133 van het MTHFR-gen , rs1650697 en rs442767 van het DHFR-gen , rs1805087 van het MTR-gen , rs11545078 van het GGH-gen en rs1051298 van SLC19A1. Mutatie in andere secties kan niet worden gedetecteerd. Vanwege de aanzienlijke heterogeniteit in tumorweefsel kunnen verschillende bemonsteringslocaties de detectieresultaten beïnvloeden. Voor in paraffine ingebedde weefselmonsters die voor langere tijd worden bewaard, kunnen DNA en RNA tot op zekere hoogte worden afgebroken, wat de testresultaten beïnvloedt. Onredelijke monsterverzameling, transport en verwerking, evenals onjuiste experimentele werking en experimentele omgeving kunnen leiden tot vals-negatieve of vals-positieve resultaten. Het detectieresultaat kan niet worden gegarandeerd als de nucleïnezuurconcentratie lager is dan 2 ng/μL. De testresultaten van de kit zijn alleen ter klinische referentie. De selectie van gepersonaliseerde behandeling voor patiënten moet worden overwogen in combinatie met hun symptomen/tekenen, medische geschiedenis, andere laboratoriumtests en behandelingsreacties. Negatieve resultaten kunnen het bestaan van doelgenmutatie niet volledig uitsluiten. Negatieve resultaten kunnen ook worden veroorzaakt door te weinig tumorcellen in het monster, overmatige afbraak van nucleïnezuur of de concentratie van het doelgen in het amplificatiereactiesysteem onder de detectielimiet.

Sommige prestatie-indexen van de gebruikte kit zijn zoals beschreven. Analytische gevoeligheid: Voor DNA-monsters is de minimaal detecteerbare hoeveelheid van het totale nucleïnezuur in deze kit 10 ng en kan een mutatiesnelheid van 5% worden gedetecteerd. Voor RNA-monsters is de minimaal detecteerbare hoeveelheid van het totale nucleïnezuur in deze kit 10 ng. Percentage positieve en negatieve toeval: Het percentage positieve en negatieve coïncidentie bereikt 100%. Detectielimiet (LOD): In totaal kunnen 14 LOD-referenties, genummerd L1-L14, worden gebruikt. L1-L11 zijn LOD-referenties van MTHFR-, DHFR-, MTR-, GGH- en SLC19A1-genen , en hun detectieresultaten moeten zijn dat de mutatietypen van de overeenkomstige genenplaatsen positief zijn en dat de coïncidentiepercentages 100% zijn. Herhaalbaarheid: Er kunnen in totaal vijf repetitieve referentiematerialen, genummerd R1-R5, worden gebruikt. R1 is een sterk positief repetitief referentiemateriaal (rs67376798 mutatie van het DPYD-gen ). R2, dat deze mutatie in een kleiner aantal bevat, is een zwak positief repetitief referentiemateriaal (rs67376798-mutatie van het DPYD-gen ), R3 is een negatief repetitief referentiemateriaal (6 plaatsen van de DPYD-, MTHFR – en ABCB1-genen worden gedetecteerd als wildtype). Elk referentiemonster moet 10 keer worden getest, om ervoor te zorgen dat de resultaten van deze herhaalde beoordelingen overeenkomen met hun vooraf gedefinieerde classificaties. Gegevensvolume: Het effectieve gegevensvolume van DNA- en RNA-monsters moet worden gecontroleerd boven 0,05 M. De sequentiediepte van DNA-monsters moet worden gecontroleerd boven 500 en de in kaart gebrachte lezingen van RNA-monsters moeten worden gecontroleerd boven 20000. Interferentietest: Deze kit wordt niet beïnvloed door endogene interferentiestoffen (triglyceriden en albumine) en exogene interferentiestoffen (formaline en gedehydrateerde alcohol).

Tijdens het experiment moeten enkele voorzorgsmaatregelen in acht worden genomen. De kit die hier wordt gebruikt, kan alleen worden gebruikt voor in-vitrotesten. Lees deze handleiding aandachtig door voor het experiment en gebruik deze binnen de geldigheidsperiode. Componenten van de kit in verschillende batches kunnen niet door elkaar worden gebruikt. Het wordt aanbevolen om voor deze kit wegwerpverbruiksartikelen te gebruiken om besmetting te voorkomen. Tijdens het gebruik van deze kit is het aan te raden om een zuigkop met een filterelement te gebruiken. Om mogelijke biologische gevaren in het monster te voorkomen, moet het testmonster worden beschouwd als infectieuze stoffen om contact met huid en slijmvliezen te vermijden. Het wordt aanbevolen om de monsters in een bioveiligheidskast te hanteren die de uitstroom van aerosolen kan voorkomen. Reageerbuizen en zuignappen die bij de operatie worden gebruikt, moeten worden gesteriliseerd voordat ze worden weggegooid. Het gebruik en de verwijdering van monsters moeten voldoen aan de vereisten van de relevante wet- en regelgeving: Algemene richtlijnen voor bioveiligheid van microbiële biomedische laboratoria en voorschriften voor het beheer van medisch afval van het ministerie van Volksgezondheid30,31. Het experimentele personeel moet een professionele training krijgen, in strikte overeenstemming met de instructies werken en de gebieden strikt scheiden volgens het experimentele proces. In elke fase van de experimentele actie moeten speciale instrumenten en apparatuur worden gebruikt en de artikelen in elke fase van elke zone mogen niet door elkaar worden gebruikt. Het experimentele personeel moet de gebieden strikt scheiden volgens het experimentele proces. In elk stadium van de experimentele actie moeten speciale instrumenten en apparatuur worden gebruikt. Neem indien nodig beschermende maatregelen, zoals handschoenen, werkkleding, enz. De verwijdering van afvalstoffen moet voldoen aan de relevante nationale voorschriften.

Hoewel de focus van dit artikel ligt op de zeven SNP’s binnen vijf genen die verband houden met maagkanker, is de sequencing in praktische toepassingen niet beperkt tot deze vijf genen alleen. Dit artikel stelt definitief een significante correlatie vast tussen de zeven SNP’s en de gevoeligheid voor 5-FU-chemotherapie bij maagkanker.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie wordt ondersteund door Onderzoek naar het mechanisme en de rol van de ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL-route bij de resistentie van maagkankercellen tegen door apatibi geïnduceerde ferrotoptose (artikelnummer: 82172814), ondersteund door de National Nature Science Foundation of China; Onderzoek naar de rol en het mechanisme van zinkvingertranscriptiefactor 1 bij het moduleren van maagkankercelresistentie tegen ferrotose geïnduceerd door apatinib via de meervoudig onverzadigde etherfosfolipideroute (artikelnummer: 2022A1515010267), ondersteund door het Provinciaal Comité van Guangdong voor de financiering van fundamenteel en toegepast onderzoek; en het onderzoek en de toepassing van reagens voor de diagnose van 5-FU-chemositiviteit voor maagkanker (artikelnummer: 201903010072), wetenschaps- en technologieprojecten in Guangzhou.

Materials

1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
Amplification primer of gastric cancer Thermo Fisher The primers are sythesized by Thermo Fshier according to the sequence in Table 1.
Deparaffinization Qiagen 19093
DNA purification magnetic beads Bechkman A63881
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent
Factory Thermo Fisher Scientific		 http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher 4480441
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Pipette tips  Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
PureLink RNA Mini Columns Thermo Fisher A29839
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit Thermo Fisher AM1975
Tabletop mini centrifuge SCILOGES S1010E
Thermal Cycler Life Technologies 4375786
Ultramicro nucleic acid analyzer BEIJING ORIENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT LTD. BD-1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8, (2017).
  3. Shah, M. A., et al. Immunotherapy and targeted therapy for advanced gastroesophageal cancer: Asco guideline. J Clin Oncol. 41 (7), 1470-1491 (2023).
  4. Loganayagam, A., et al. Pharmacogenetic variants in the dpyd, tyms, cda and mthfr genes are clinically significant predictors of fluoropyrimidine toxicity. Br J Cancer. 108 (12), 2505-2515 (2013).
  5. Giacchetti, S., et al. Phase iii multicenter randomized trial of oxaliplatin added to chronomodulated fluorouracil-leucovorin as first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 18 (1), 136-147 (2000).
  6. Hoff, P. M., et al. Comparison of oral capecitabine versus intravenous fluorouracil plus leucovorin as first-line treatment in 605 patients with metastatic colorectal cancer: Results of a randomized phase iii study. J Clin Oncol. 19 (8), 2282-2292 (2001).
  7. Meulendijks, D., et al. Clinical relevance of dpyd variants c.1679t>g, c.1236g>a/hapb3, and c.1601g>a as predictors of severe fluoropyrimidine-associated toxicity: A systematic review and meta-analysis of individual patient data. Lancet Oncol. 16 (16), 1639-1650 (2015).
  8. Sadighi, S., Mohagheghi, M. A., Montazeri, A., Sadighi, Z. Quality of life in patients with advanced gastric cancer: A randomized trial comparing docetaxel, cisplatin, 5-fu (tcf) with epirubicin, cisplatin, 5-fu (ecf). BMC Cancer. 6, 274 (2006).
  9. Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
  10. Ladner, R. D. The role of dutpase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy. Curr Protein Pept Sci. 2 (4), 361-370 (2001).
  11. Capitain, O., et al. The influence of fluorouracil outcome parameters on tolerance and efficacy in patients with advanced colorectal cancer. Pharmacogenomics J. 8 (4), 256-267 (2008).
  12. Askari, B. S., Krajinovic, M. Dihydrofolate reductase gene variations in susceptibility to disease and treatment outcomes. Curr Genomics. 11 (8), 578-583 (2010).
  13. Ceppi, F., et al. DNA variants in dhfr gene and response to treatment in children with childhood b all: Revisited in aieop-bfm protocol. Pharmacogenomics. 19 (2), 105-112 (2018).
  14. Sharp, L., Little, J. Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and colorectal neoplasia: A huge review. Am J Epidemiol. 159 (5), 423-443 (2004).
  15. Yousef, A. M., et al. The association of polymorphisms in folate-metabolizing genes with response to adjuvant chemotherapy of colorectal cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 82 (2), 237-243 (2018).
  16. Schneider, E., Ryan, T. J. Gamma-glutamyl hydrolase and drug resistance. Clin Chim Acta. 374 (1-2), 25-32 (2006).
  17. Moran, R. G. Roles of folylpoly-gamma-glutamate synthetase in therapeutics with tetrahydrofolate antimetabolites: An overview. Semin Oncol. 26 (2), 24-32 (1999).
  18. Maezawa, Y., et al. High gamma-glutamyl hydrolase and low folylpolyglutamate synthetase expression as prognostic biomarkers in patients with locally advanced gastric cancer who were administrated postoperative adjuvant chemotherapy with s-1. J Cancer Res Clin Oncol. 146 (1), 75-86 (2020).
  19. Cheng, Q., et al. A substrate specific functional polymorphism of human gamma-glutamyl hydrolase alters catalytic activity and methotrexate polyglutamate accumulation in acute lymphoblastic leukaemia cells. Pharmacogenetics. 14 (8), 557-567 (2004).
  20. Zhang, Q., et al. Recognition of cyclic dinucleotides and folates by human slc19a1. Nature. 612 (7938), 170-176 (2022).
  21. Ulrich, C. M., et al. Polymorphisms in folate-metabolizing enzymes and response to 5-fluorouracil among patients with stage ii or iii rectal cancer (int-0144; swog 9304). Cancer. 120 (21), 3329-3337 (2014).
  22. Zhang, X., et al. Discovery of novel biomarkers of therapeutic responses in han chinese pemetrexed-based treated advanced nsclc patients. Front Pharmacol. 10, 944 (2019).
  23. Corrigan, A., et al. Pharmacogenetics of pemetrexed combination therapy in lung cancer: Pathway analysis reveals novel toxicity associations. Pharmacogenomics J. 14 (5), 411-417 (2014).
  24. Ion 520 & ion 530 ext kit – chef user guide. Thermofisherscientific Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf (2023)
  25. Ion genestudio s5 instrument user guide. Thermofisherscientific Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf (2023)
  26. Parkin, N. T., et al. Multi-laboratory comparison of next-generation to sanger-based sequencing for hiv-1 drug resistance genotyping. Viruses. 12 (7), 694 (2020).
  27. Ziller, M. J., Hansen, K. D., Meissner, A., Aryee, M. J. Coverage recommendations for methylation analysis by whole-genome bisulfite sequencing. Nat Methods. 12 (3), 230-232 (2015).
  28. Lordick, F., et al. Unmet needs and challenges in gastric cancer: The way forward. Cancer Treat Rev. 40 (6), 692-700 (2014).
  29. Kumar, K. R., Cowley, M. J., Davis, R. L. Next-generation sequencing and emerging technologies. Semin Thromb Hemost. 45 (7), 661-673 (2019).
  30. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. Ministry of Health of the People’s Republic of China. WS 233-2002. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. , 1-64 (2002).
  31. China Environmental Protection Industry. Medical waste management regulations. China Environmental Protection Industry. (1), 6-10 (2004).

Tags

Gastric CancerSingle Nucleotide PolymorphismsSNPs5-fluorouracil5-FUPharmacogeneticsMTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1Ion Semiconductor SequencingNext-generation Sequencing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, K., Yan, X., Huang, Z., Liang, H., Li, Z., Wang, M., Wan, Y., Wang, S., Zhao, L. Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (207), e66058, doi:10.3791/66058 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image