JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Mide Kanserinde İyon Yarı İletken Dizileme Platformuna Dayalı Çok Genli Tek Nükleotid Polimorfizmi Tespiti

Published: May 10, 2024
doi:
10.3791/66058
, , , , , , , ,
1Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2Research and Development Department,Guangzhou Darui Biotechnology Co., Ltd, 3Key Laboratory of Antibody Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University, 4Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy,Southern Medical University

Summary

Bu protokol, bir iyon yarı iletken dizileme platformuna dayalı olarak mide kanseri örneklerinde tek nükleotid polimorfizmlerini tespit etmek için gerekli bütünsel laboratuvar prosedürlerini önermektedir. Hedef diziler, bağlama adaptörleri, kütüphane amplifikasyonu ve saflaştırması ve kalite kontrol kriterleri de ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Abstract

Mide kanseri sık görülen heterojen bir tümördür. Çoğu hasta tanı anında ilerlemiş mide kanserine sahiptir ve sıklıkla kemoterapiye ihtiyaç duyar. 5-florourasil (5-FU) tedavi için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, terapötik duyarlılığı ve ilaç toleransının hala belirlenmesi gerekmektedir, bu da bireyselleştirilmiş uygulamanın önemini vurgulamaktadır. Farmakogenetik, bireyselleştirilmiş tedavinin klinik uygulamasına rehberlik edebilir. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP’ler), genetik bir belirteç olarak, uygun kemoterapi rejimlerinin ve dozajlarının seçimine katkıda bulunur. Bazı SNP’ler, 5-FU’nun terapötik hedefi olan folat metabolizması ile ilişkilidir. Metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) rs1801131 ve rs1801133, dihidrofolat redüktaz (DHFR) rs1650697 ve rs442767, metiyonin sentaz (MTR) rs1805087, gama-glutamil hidrolaz (GGH) rs11545078 ve çözünen taşıyıcı ailesi 19 üye 1 (SLC19A1) rs1051298, aşağıdakiler için potansiyel tahmin ve yol gösterici öneme sahip farklı kanser türlerinde ve antifolat antitümör ilaçlarda araştırılmıştır 5-FU uygulaması. İyon torrent yeni nesil yarı iletken dizileme teknolojisi, mide kanseri ile ilgili SNP’leri hızlı bir şekilde tespit edebilir. Bir DNA zincirinde bir baz her uzatıldığında, bir H + salınacak ve bu da yerel pH değişikliklerine neden olacaktır. İyonik sensör, pH değişikliklerini algılar ve kimyasal sinyalleri dijital sinyallere dönüştürerek sentez yoluyla sıralama sağlar. Bu teknik, SNP’ler tarafından kişiselleştirilmiş kemoterapiye rehberlik etmek için faydalı olan düşük numune gereksinimine, basit kullanıma, düşük maliyete ve hızlı sıralama hızına sahiptir.

Introduction

Mide kanseri, küresel halk sağlığı alanında ağır bir yüktür. Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı (IARC) tarafından yayınlanan Küresel Kanser İstatistikleri 2020’ye göre, mide kanseri en çok teşhis edilen beşinci kanser ve kansere bağlı ölümlerin dördüncü önde gelen nedenidir. Dünya genelinde, Doğu Asya’da yaşa standardize edilmiş oran insidansı hem erkeklerde hem de kadınlarda en yüksektir1. Mide kanserinin oluşumu sinsidir, bu da hastaların erken evrede genellikle belirgin ve spesifik semptomları olmadığı anlamına gelir. Tüm mide kanseri hastaları arasında, rutin taraması olmayan ülkelerde, hastaların %80-90’ı ya tümörün ameliyat edilemeyeceği ileri evrede tanı almakta ya da ameliyattan sonraki 5 yıl içinde nüks etmektedir2.

İlerlemiş veya metastatik mide kanseri için kemoterapi, hastaların hayatta kalma oranını ve yaşam kalitesini artırabilen ana tedavidir. Metastatik mide kanserli hastaların ilk tedavisi için, birinci basamak kemoterapötik rejim için bir platin-floropirimidin rejimi temel seçimdir3. Floropirimidin esas olarak 5-florourasil (5-FU) ve kapesitabin ve tegafur gibi oral floropirimidin türevlerini içerir. 5-FU’nun ana hedefi, DNA sentezini inhibe eden ve tümör dokusunun büyümesini yavaşlatan folat metabolizması ile ilgili enzimlerdir. Advers ilaç reaksiyonları, en sık görülen yan etkiler arasında ishal, mukozit, miyelosupresyon ve el-ayak sendromu ile faydalarını sınırlar. Terapötik yanıt ve advers ilaç reaksiyonlarının folat metabolik yolağındaki faktörlerle yakından ilişkili olduğu bildirilmiştir. Özellikle, rs1801131’in homozigot mutasyonu el-ayak sendromu için bir gösterge olarak tanımlanmıştır (p = 4.1 x 10-6, OR =9.99,% 95 CI: 3.84-27.8)4. Floropirimidinler antikanser kemoterapisinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kemorezistansları yaygın bir acil durumdur ve mide kanseri tedavisinde terapötik başarısızlığa neden olur. Örneğin, genel yanıt oranı sadece 5-FU ile tedavi edilen ileri kolorektal kanserli hastalarda sadece% 10 -% 15’tir5. Ayrıca, floropirimidinler göz ardı edilemeyecek toksisiteye sahiptir. 5-FU’nun neden olduğu toksisite reaksiyonları esas olarak ishal, el-ayak sendromu, stomatit, nötropeni, trombositopeni, nörotoksisite ve hatta ölümü içerir6. Floropirimidinler ile tedavi edilen hastaların %10-30’unda tedaviye bağlı ciddi toksisite görülür ve bu hastaların %0.5-1’inde ölümcül toksisite görülür7.

İlerlemiş mide kanseri olan hastalar üzerinde yapılan bir yaşam kalitesi çalışması, 5-FU bazlı kemoterapi alanlar için yanıt oranının %50’den az olduğunu bulmuştur8. Bu nedenle, 5-FU bazlı kemoterapinin duyarlılığı ile ilgili faktörlerin anlaşılması, toksisiteyi en aza indirirken yanıt oranını ve etkinliği en üst düzeye çıkarmak için kesin tedavi için özellikle önemlidir. 5-FU’nun folat metabolizması ile yakından ilişkili olduğu göz önüne alındığında, folat metabolik yolağındaki enzimlerin genetik varyantları faktörlerden biri olabilir. İnsan dizi varyasyonunun yaklaşık% 90’ı, tek nükleotid polimorfizmleri (SNP’ler) olarak bilinen DNA’daki tek baz mutasyonlarına atfedilir9. SNP’ler folat metabolizmasının enzim özelliklerini değiştirdiğinde, mide kanseri hastalarında florouraseile etkinlik, toksisite ve kemorezistansta bireysel farklılıklara yol açabilir.

Metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) esas olarak 5,10-metilentetrahidrofolatı (5,10-MTHF) 5-metiltetrahidrofolata dönüştürmek için kullanılır. 5-FU’nun bir metaboliti olan 5-FdUMP, 5,10-MTHF ve timidilat sentaz (TS) ile inaktif üçlü oluşturur, TS’nin aktivitesini inhibe eder ve dTMP10 eksikliğine yol açar. 5,10-MTHF birikimi, 5-FU’nun TS üzerindeki inhibisyon etkisini artırabilir, bu da MTHFR’nin aktivitesi ile ilişkilidir. MTHFR rs1801131 ve rs1801133, düşük enzim aktivitesi (rs1801133 için %75 ve rs181131 için %30’luk bir azalma) ve 5,10-MTHF birikimi ile ilişkili en yaygın polimorfizmlerdir11.

Dihidrofolat redüktaz (DHFR), folat metabolizmasında ve DNA sentezinde anahtar enzimdir. DHFR, NADPH kullanarak dihidrofolatı, tek karbonlu birimi taşımak için kullanılan tetrahidrofolata (THF) indirger. DHFR’nin SNP’leri ekspresyonunu etkileyebilir, THF’nin aktivitesini ve bolluğunu değiştirebilir ve folat metabolizmasını ve 5-FU’nun duyarlılığını daha da etkileyebilir. DHFR rs1650697 nokta mutasyonu, DHFR geninin ana promotöründe meydana gelir ve bu da DHFR ekspresyonunu12 arttırır. Bir çalışma, rs442767’nin pemetreks ve metotreksat gibi antifolat antitümör ilaçların etkinliği ve toksisitesi ile ilişkili olduğunu bulmuştur. SNP rs442767 ile ilgili olarak, bir GT genotipi, her bir ebeveynden homolog kromozomlar üzerinde aynı lokusta bir G aleli ve bir T alelinin kalıtımını ifade eder. Benzer şekilde, GG ve TT genotipleri, buna uygun olarak iki G alelinin veya iki T alelinin kalıtımını gösterir. GT + TT genotipi ile karşılaştırıldığında, GG olaysız sağkalımın azalması ve artmış risk13 ile ilişkilidir. Bu, rs442767’nin 5-FU üzerinde belirli potansiyel etkilere yol açabileceğini düşündürmektedir.

Metiyonin sentaz (MTR), folat metabolizmasında önemli bir rol oynayan homosisteinin metiyonine yeniden metilasyonunu katalize eder. MTR rs1805087, MTR geninin en sık görülen polimorfizmidir. MTR rs1805087, potansiyel olarak işlevsel protein bölgesinde aspartik asit yerine glisin kullanır ve bu da MTR’nin aktivitesini azaltabilir. G alleli olan deneklerde plazma folat seviyesi artmış ve plazma homosistein seviyesi14 azalmıştır. Aksine, bir çalışma rs1805087’nin 5-FU’nun etkinliği ile istatistiksel olarak anlamlı bir ilişkisi olmadığını gösterdi. Ancak bu çalışma kolorektal kansere odaklandı ve örneklem büyüklüğü küçüktü. Mide kanseri hastalarında rs1805087 ile 5-FU’nun etkinliği arasındaki ilişki araştırılmayı beklemektedir15.

Gama-glutamil hidrolaz (GGH), hücre içi folat konsantrasyonlarını düzenleyen lizozomal bir enzimdir. Pteroilglutamik asit, pterin, p-aminometilbenzoik asit ve glutamik asitten oluşan folik asidin eş anlamlısıdır. Organizmalarda monoglutamat folat ve poliglutamat folat olmak üzere iki folik asit formu vardır. THF-poliglutamat, GGH tarafından enzimatik olarak monoglutamik folata dönüştürülür ve art arda mono-Glutamat (mono-Glu) veya di-Glutamat (di-Glu)16 salınır. Lokal ileri mide kanseri olan hastalarda GGH ekspresyonu ile ilgili bir çalışma, yüksek GGH ekspresyonunun 5,10-MTHF ve TS’yi azaltabileceğini göstermiştir, bu da bu hastalarda TS inhibitör etkisini elde etmek için sadece küçük bir 5-FU dozunun gerekli olduğu anlamına gelir17. GG, 5-FU’nun bir ön ilacı olan S-1 ile postoperatif adjuvan kemoterapi ile tedavi edilen lokal ileri mide kanserli hastalarda prognostik bir biyobelirteçtir ve folik asit18’in hücre içi homeostazının korunmasında önemli bir rol oynar. GGH rs11545078 yanlış anlamlı bir varyanttır ve Thr-127’yi Ile-127’ye değiştirir. GGH’nin substrat özgüllüğüne odaklanan bir çalışma, rs11545078’in vahşi tipe kıyasla metotreksat için daha yüksek Km ve daha düşük katalitik verim ile sonuçlandığını ve yapının folik asit19’a benzer olduğunu göstermektedir. Birlikte, rs11545078 ile 5-FU’nun klinik sonuçları arasındaki ilişkiyi araştırmak, ilaç direncini anlamak için umut verici bir stratejidir.

İndirgenmiş folat taşıyıcı olarak da adlandırılan çözünen taşıyıcı ailesi 19 üye 1 (SLC19A1), memeli hücrelerinin de novo sentezleme yeteneğinden yoksun olduğu indirgenmiş folatları ithal eden tipik bir kolaylaştırıcı transmembran proteinidir ve bu, tümörün 5-FU20’ye tepkisini tahmin etmek için kabul edilmektedir. Bununla birlikte, 5-FU ve SLC19A1 polimorfizmi arasındaki ilişki ile ilgili sadece birkaç çalışma yapılmıştır21. Bir folat analoğu olan pemetrexed alan küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda, SLC19A1 genindeki rs1051298, tüm advers ilaç reaksiyonu riskini artırmaya ve genel sağkalımı azaltmaya katkıda bulunmuştur22,23. SLC19A1 folat metabolizması hakkında 3’çevrilmemiş bir bölge varyantı olan rs1051298, 5-FU tedavisi ile ilgili bazı bireysel farklılıkları açıklamaya yardımcı olabilir. Burada amaç, mide kanserli hastalarda rs1051298 ile 5-FU direnci arasındaki ilişkiyi değerlendirmektir.

Yarı iletken dizilemeye dayalı bir kit, in vitro olarak kalitatif gen tespiti için kullanılır (Şekil 1), 5 gende seçilen 7 SNP’yi, MTHFR geninin rs1801131 ve rs1801133 mutasyonlarını, DHFR geninin rs1650697 ve rs442767 mutasyonlarını, MTR geninin rs1805087 mutasyonunu, GGH geninin rs11545078 mutasyonunu ve SLC19A1 rs1051298’ini tespit edebilir mide kanseri hastalarının tümör dokusu örneklerinde gen. İlk olarak, numune nükleik asidi ekstrakte edildi ve hedef fragman, PCR ile spesifik olarak amplifiye edildi. Dizileme için kullanılabilecek bir kütüphane oluşturmak için DNA parçasının her iki ucuna evrensel bir dizileme adaptörü eklendi. Daha sonra bir sıralama şablonu oluşturmak için dizileme kütüphanesinin PCR ile amplifikasyonu yapıldı. Pozitif şablon, sıralama gereksinimlerini karşılayacak şekilde zenginleştirildi. Yarı iletken dizileme sistemini kullanarak, DNA zincirini yarı iletken çipin küçük deliğine sabitleyerek. DNA polimeraz, tek sarmallı DNA’yı şablon olarak alır ve tamamlayıcı baz eşleşmesi prensibine göre tamamlayıcı DNA zincirini sentezler. Bir DNA zincirinde bir baz her uzatıldığında, bir proton salınacak ve bu da yerel pH değişikliklerine neden olacaktır. İyonik bir sensör, pH değişikliklerini algılar ve kimyasal sinyalleri dijital sinyallere dönüştürür, böylece bazlar gerçek zamanlı olarak yorumlanabilir ve son olarak her bir DNA segmentinin baz dizisi elde edilebilir. Bu dizileri insan genomunun referans haritasıyla eşleştirmek için biyoinformatik analiz kullanıldı. Mide kanseri ile ilgili genler mutasyona uğradığında, ilgili genlerin mutasyon bilgisini elde etmek için karşılık gelen DNA baz dizileri değişecektir.

Sonuç, gen mutasyon durumunu gösterebilir ve klinisyenlere uygun kemoterapi ilaçlarının türlerini ve dozajlarını seçmeleri ve mide kanseri hastaları için ilaç direncini tahmin etmeleri için referans sağlayabilir. Bununla birlikte, test sonuçları sadece klinik referans içindir ve hastaların bireyselleştirilmiş tedavisi için tek temel olması önerilmez. Klinisyenler hastanın durumuna, ilaç endikasyonlarına, tedavi reaksiyonlarına ve diğer laboratuvar test göstergelerine dayanarak kapsamlı bir karar vermelidir.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan, üst gastrointestinal endoskopi veya cerrahiden elde edilen mide kanserine ait tüm protokoller ve doku örnekleri (basamak 1) 24 Temmuz 2023 tarihinde tıp etik kurulu tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (NFEC-2023-298). Ayrıca, bu protokol, kohort karşılaştırmalarına girmeden mide kanserinde çoklu gen tespitini göstermek için özel olarak tasarlanmıştır, bu nedenle hastaları dahil etmek veya hariç tutmak için belirli bir kriter getirmez. Hastalar/katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onamlarını verdiler. 1. Mide kanserinin gömülü bloklarının hazırlanması Sıcak ve soğuk plakaların yanı sıra bir parafin rezervuarı ve dağıtıcıdan oluşan doku gömme sistemini, belirtilen operasyonel yönergeleri izleyerek yapılandırın. Gömme için hazırlanan dokuyu kurutucudan çıkarın ve gömme merkezinin saklama yuvasına yerleştirin. Doku boyutuna göre uygun gömme kalıplarını seçin, dokuyu kaplayacak kadar miktarda erimiş parafin dökün ve ardından kalıbı ılık plakaya yerleştirin. Dokuyu kasetlerden alın ve kesit düzleminin tüm doku katmanlarını kestiğinden emin olmak için mide mukozasını gömme kalıbın tabanına dik olarak yerleştirin. Dokuyu kalıpta hizalayın. Kaseti kalıbın üstüne yerleştirin, ardından kalıbı doldurarak ikincil bir parafin dökün. Gömülü kalıbı soğuk plakaya yerleştirin ve parafinin katılaşmasını takiben gömülü blokları kalıplardan koparın. 2. Numunelerden nükleik asit ekstraksiyonu Parafine gömülü doku örneklerinden nükleik asitleri çıkarmak için nükleik asit ekstraksiyon ve saflaştırma kitleri kullanın. Ekstrakte edilen nükleik asidi ölçmek için bir nükleik asit niceleyici kullanın. Nükleik asit konsantrasyonunun 2 ng/μL’den büyük olması önerilir.NOT: Burada kullanılan malzemeler Malzeme Tablosu’nda mevcuttur. 3. Sıralama kitaplığı için hazırlık Deney öncesi hazırlıkUltra temiz tezgahtaki UV lambasını AÇIN, 30 dakika sterilize edin. Ardından, UV lambasını KAPATIN ve 10 dakika havalandırmak için fanı AÇIN. Nükleik asidi -20 ± 5 °C buzdolabından çıkarın, numune kimliğini, nükleik asit barkodunu ve numuneye atanan özel etiket etiket numarasını kontrol edin ve kaydedin. Doğrulamadan sonra oda sıcaklığında (RT) çözünmesi için santrifüj tüpü rafına koyun ve bekleme için sabit 2.500 x g ile 10 saniye santrifüjleyin. Hedef fragmanın PCR amplifikasyonuÖzel yapım mide kanseri çok genli eklem tespit kitinden parça yakalama reaksiyon solüsyonunu, mide kanseri amplifikasyon primerini ve füzyon amplifikasyon primerini alın ve eritmek için buza koyun. Eridikten sonra çalkalayın ve karıştırın, 10 saniye santrifüjleyin ve nükleaz içermeyen su hazırlayın. Ayrıntılı astar bilgileri Tablo 1’de gösterilmektedir.NOT: Kit henüz ticari olarak mevcut değildir, daha fazla ayrıntı için authotrs ile iletişime geçin. 0.2 mL’lik bir PCR reaksiyon tüpü hazırlayın, Ek Tablo 1’e göre sırayla tüpe reaktifler ekleyin, 5 saniye boyunca girdap yapın ve karıştırın ve sabit 2.500 x g ile 10 saniye boyunca anında santrifüjleyin, böylece tüp duvarında ve kapağında belirgin bir düşüş olmaz. RNA örnekleri cDNA’ya ters kopyalanacak ve daha sonra sonraki kütüphane yapımı için kullanılacaktır. cDNA ürünleri, Ek Tablo 2’ye göre sırayla tüplere eklenecektir. Her reaksiyon tüpünü termal döngüleyiciye yerleştirin. DNA örnekleri için, Tablo 2’de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi amplifikasyon programını çalıştırın. cDNA ürünleri için, amplifikasyon programını Tablo 3’te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalıştırın. Astar dizisinin sindirimiAstar sindirim enzimini çıkarın ve erimesi için buzun üzerine koyun. Amplifikasyondan sonra, yukarıdaki reaksiyon tüplerini çıkarın, her tüpe 2 μL primer sindirim enzimi ekleyin ve toplam hacmin 22 μL olduğundan emin olun. Reaksiyon çözeltisini PCR tüpünde girdaplayın ve karıştırın ve sabit 2.500 x g ile 10 saniye boyunca anında santrifüjleyin. Her bir reaksiyon tüpünü termal döngüleyiciye koyun ve programı Tablo 4’te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalıştırın. Adaptörün ligasyonuAdaptör bağlantı reaktiflerini çözünmesi için buzun üzerine koyun. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın ve ardından her bir bileşeni Tablo 5’e göre karıştırın ve adaptör karışımı X olarak işaretleyin.NOT: Adaptör bağlantı reaktifleri, P1 adaptörlerini ve 1’den 48’e kadar numaralandırılmış özel adaptörler X’i içerir. Bunlar, çeşitli örnekleri benzersiz bir şekilde etiketlemek için tasarlanmıştır. Belirli bir adaptör eklerken, belirli adaptörün çapraz kontaminasyonunu önlemek için her seferinde yalnızca bir tüp açın. Seyreltilmiş özel adaptör karışımı, bekleme için -20 ± 5 °C’de saklanabilir. Sıralama iş akışlarında, örnekler tek tek işlenmez, bunun yerine her biri belirli bir adaptörle etiketlenmiş birden çok örnek, sıralama için birleşik bir kitaplıkta birleştirilir. Bu yöntem, numunelerin daha sonra belirli adaptör dizilerine göre ayırt edilmesini sağlar. Sindirilmiş astar ürününü (22 μL) termal döngüleyiciden çıkarın. Tablo 6’ya göre sırayla tüpe reaktifler ekleyin, girdap yapın ve 5 saniye karıştırın. Sabit 2.500 x g ile 10 saniye boyunca düşük hızda santrifüjleyin, böylece tüpün duvarında ve kapağında belirgin bir düşüş olmaz. Reaksiyon tüpünü termal döngüleyiciye yerleştirin. DNA örnekleri için, Tablo 7’de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi amplifikasyon programını çalıştırın. cDNA ürünleri için, amplifikasyon programını Tablo 8’de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalıştırın. Ligasyon ürününün saflaştırılması ve amplifikasyonuDNA saflaştırma manyetik boncuklarını önceden 2-8 ° C’lik buzdolabından çıkarın, eşit şekilde girdaplayın ve sabit 2.500 x g ile 10 saniye boyunca anında santrifüjleyin. Manyetik boncukları RT’de 30 dakika dengeleyin. 1.5 mL düşük adsorpsiyonlu bir mikrosantrifüj tüpü hazırlayın ve ligasyon reaksiyonunun ürününü ilgili tüpe aktarın. Her tüpe 45 μL DNA saflaştırılmış manyetik boncuk ekleyin, girdap yapın ve iyice karıştırın, 10 saniye boyunca anında santrifüjleyin ve RT’de 5 dakika inkübe edin. Tüpü 3 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Süpernatanı atın ve boncukları pipetlemekten kaçının. 300 μL yeni hazırlanmış% 75 etanolü mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri 180 ° C’de 4x hafifçe döndürün. Çözelti berraklaştıktan sonra, süpernatanı hızlı bir şekilde atın. Boncukları pipetlemekten kaçının. Yıkama işlemini 1 kat daha tekrarlayın. 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerini mıknatıs rafından çıkarın ve kısa bir süre santrifüjleyin (10 sn, sabit 2.500 x g ile). Tüpleri tekrar mıknatıs rafına yerleştirin ve kalan sıvıyı pipetleyin. Tüp duvarında artık sıvı olmadığından emin olun. Her 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünün kapağını açın ve boncukları RT’de 5 dakika kurutun. Boncukların kuru-ıslak durumuna dikkat edin. Manyetik boncuklar kuruduktan sonra yüzeyde su lekesi olup olmadığını kontrol edin. Manyetik boncuklar çok ıslaksa kuruma süresini uygun şekilde uzatın. Boncuklarda herhangi bir çatlak oluşursa hemen kapağı kapatın ve kitaplığı büyütmek ve saflaştırmak için bir sonraki adıma geçin. Kütüphanenin amplifikasyonu ve saflaştırılmasıPCR ile ilgili reaktifleri önceden çözünmesi için buza koyun, girdaplayın ve 10 saniye santrifüjleyin. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü mıknatıs rafından çıkarın, PCR tutucularını Tablo 9’a göre tüpe pipetleyin ve kapağı ve girdabı 5 saniye boyunca kapatın. Tüp duvarında ve kapağında belirgin bir sıvı damlası oluşmaması için kısa bir süre (10 sn) santrifüjleyin. Yukarıdaki ürünü yeni bir PCR tüpüne aktarın. Numuneyi bir termal döngüleyici üzerinde inkübe edin. DNA örnekleri için, Tablo 10’da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi amplifikasyon programını çalıştırın. cDNA ürünleri için, amplifikasyon programını Tablo 11’de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalıştırın. Yeni bir 1.5 mL düşük adsorpsiyonlu mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. İnkübasyondan sonra PCR tüpünü 10 saniye santrifüjleyin. Ürünü PCR tüpünden EP tüpüne aktarın. Her tüpe 25 μL DNA saflaştırılmış manyetik boncuk ekleyin. Girdap yapın ve iyice karıştırın, düşük hızda santrifüjleyin ve RT’de 5 dakika inkübe edin. Tüpleri 3 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin. Süpernatanı yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Boncukları pipetlemekten kaçının. Her tüpe 60 μL DNA saflaştırılmış manyetik boncuk ekleyin. Girdap yapın ve iyice karıştırın, düşük hızda santrifüjleyin ve RT’de 5 dakika inkübe edin. Tüpleri 3 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin. Süpernatanı atın. Boncukları pipetlemekten kaçının. Yeni hazırlanan% 75 etanolün 300 μL’sini tüplere aktarın ve tüpleri 180 ° C’de 4x yavaşça döndürün. Çözelti berraklaştıktan sonra, süpernatanı hızlı bir şekilde pipetleyin ve atın. Boncukları pipetlemekten kaçının. Yıkama işlemini 1 kez tekrarlayın. 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerini manyetik raftan çıkarın ve kısa bir süre santrifüjleyin (10 sn). Tüpleri manyetik rafa geri yerleştirin ve kalan sıvıyı pipetleyin. Tüp duvarında artık sıvı olmadığından emin olun. 1,5 mL’lik tüplerin kapaklarını açın ve boncukları RT’de 5 dakika kurutun. Boncukların kuru-ıslak durumuna dikkat edin. Manyetik boncuklar kuruduktan sonra yüzeyde su lekesi oluşmaz. Manyetik boncuklar çok ıslaksa kuruma süresini uygun şekilde uzatın. Boncuklarda herhangi bir çatlak oluşursa hemen kapağı kapatın. Tüplere 50 μL eluent pipetleyin, girdap yapın ve iyice karıştırın. Kısa bir süre santrifüjleyin (5 sn, sabit 2.500 x g ile) ve tüpleri 5 dakika boyunca RT’ye yerleştirin. Tüpleri 3 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin. Sıvıyı dikkatlice yeni bir tüpe çıkarın ve kitaplık adını işaretleyin. Kitaplığı geçici olarak 2-8 °C’de bir buzdolabında saklayın ve kantitatif tayini bekleyin veya uzun süreli saklama için kitaplığı -20 ± 5 °C’de bir buzdolabında saklayın. 4. İnşa edilen kütüphanenin sayısallaştırılması Kitaplığı ölçmek için nükleik asit niceleyicisini kullanın. Kütüphane konsantrasyonu 0.2 ng/μL’≥ ise, niteliklidir. Aksi takdirde, kitaplığı yeniden oluşturun. Eşit hacimde DNA’yı (veya RNA’yı) karıştırın ve çözeltiyi ölçün. Kantitatif sonuca göre, aşağıdaki formülü kullanarak karışık çözeltiyi 100 pmol / L’ye seyreltin.NOT: Bir alternatif, formüle göre kitaplığı 100 pmol/L’ye seyreltmek ve ardından floresan kantitatif PCR ile nicelleştirmektir. PCR cihazının kantitatif sonuçlarına göre DNA (veya RNA) kütüphanelerini eşit olarak karıştırın. 100 pmol/L DNA kitaplığını ve RNA kitaplığını 4:1 oranında karıştırın. Bilgisayar dizilimi için DNA ve RNA kütüphanesinin karışık çözeltisini kullanın. 5. Sıralama Evrensel sıralama reaksiyonukiti 24,25’in (yarı iletken sıralama yöntemi) kılavuzuna bakarak sıralama yapın. 6. Numunelerin kalite kontrolü Mide kanseri DNA’sının pozitif kalite kontrolü: Mide kanserinin DNA pozitif kontrolünü alın ve testi kitin talimatlarına göre gerçekleştirin. Kontrol, kit ile birlikte sağlanır. Sonuç, MTHFR, DHFR, MTR, GGH ve SLC19A1 gen mutantlarının tespit edildiğini göstermektedir. Mide kanseri DNA’sının negatif kalite kontrolü: Mide kanserinin DNA negatif kontrolünü alın ve testi kitin talimatlarına göre yapın. Kontrol, kit ile birlikte sağlanır. Sonuç, MTHFR, DHFR, MTR, GGH ve SLC19A1 genlerinin vahşi türlerinin tespit edildiğini göstermektedir.NOT: Her iki durumda da kriterlerin karşılandığından emin olun, aksi takdirde yeniden algılama gerekir. 7. Veri analizi Örneklerin analiz sonuçlarını almak için Torrent Suite Yazılımında ilgili eklentiyi (Variant Caller, Coverage Analysis ve Ion Reporter Software) çalıştırın. Numune algılama sonuçlarını, eklentinin analiz sonuçlarına göre değerlendirin.

Representative Results

Test sonuçlarının belirlenmesi, referans aralığı olarak da kabul edilen pozitif karar değerine dayanır. Toplanan klinik örnekleri tespit etmek için yarı iletken dizileme yöntemini kullanın. MTHFR, DHFR, MTR, GGH ve SLC19A1 genlerinin mutasyon frekans değeri ≥ %5 olduğunda, tespit sonucu karşılık gelen genin mutantıdır. Mutasyon frekans değeri < %5 olduğunda, tespit sonucu karşılık gelen geninvahşi türüdür 26. Algılama sonuçlarının güvenilir olup olmadığını belirlemek için aşağıdaki kriterler kullanılabilir. İlk olarak, DNA dizileme sonuçlarının ortalama kapsamı 500’≥ ise ve RNA dizileme sonuçlarının eşlenmiş okumaları 20000’≥ ise, test sonuçları güvenilirdir27. Aksi takdirde, yeniden test edilmesi önerilir. İkinci olarak, mide kanserinin DNA pozitif kalite kontrolünün ortalama kapsamı 500’≥ ve test sonucu, MTHFR geninin rs1801131 ve rs1801133 mutasyonlarına, DHFR geninin rs1650697 ve rs442767 mutasyonlarına, MTR geninin rs1805087 mutasyonuna, GGH geninin rs11545078 mutasyonuna ve SLC19A1 rs1051298 mutasyonuna uygun olmalıdır gen pozitif olarak. Aksi takdirde, yeniden test edilmesi önerilir. Üçüncüsü, mide kanserinin DNA negatif kalite kontrolünün ortalama kapsamı 500’≥’dür ve tespit sonuçları, bu kitin tespit aralığındaki tüm bölgelerin vahşi tip olduğunu göstermelidir. Aksi takdirde, yeniden test edilmesi önerilir. Son olarak, kütüphane konsantrasyonu 0.2 ng/μL’den düşüktür, bu da numunedeki DNA veya RNA’nın bozulmasından veya deney sürecine sıkı sıkıya uyulmamasından veya deney sırasında süresi dolmuş reaktiflerin kullanılmasından kaynaklanabilir. Yukarıdaki koşullar, sıralama kalitesinin düşmesine veya başarısız olmasına neden olabilir. Kitaplığı yeniden oluşturmanız önerilir. Bu kit ile klinik örneklerden bir sıralama kütüphanesi oluşturmak için bir dizi adım izlenir. Kütüphane daha sonra bir iyon yarı iletken dizileme platformunda sıralanır ve sonuçları açıklamak için ANNOVAR kullanılır. Sıralamadan sonra, her numune için mutant türlerini özetlemek için bir belge kullanılır. Mutant bir tipin olmaması, numunenin bu spesifik mutasyona uğramadığını gösterdi. Ek Tablo3 bunun tipik bir örneğini sunmaktadır. Tablo 12 , burada tespit edilen SNP’ler hakkında temel bilgileri içermektedir. 1000 Genomes Project (1000g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; Tablo 13) ve Ekzom Agregasyon Konsorsiyumu (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Tablo 14), farklı SNP’lerin farklı popülasyonlarda önemli ölçüde mevcut olduğunu ortaya koyabilir. Şekil 1: Protokol için akış diyagramı. Yarı iletken dizileme yöntemi kullanılarak mide kanseri için çoklu gen tespitinin akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Kromozom Yer Astar tasarım aralığı Sol astar Sağ astar CHR1 11854475 CHR1:11854175-11854775 ACAGGATGGGGAAGTCACAG AAACCGGAATGGTCACAAAG 11856377 CHR1:11856077-11856677 CTTCAGGTCAGCCTCAAAGC TCCCTGTGGTCTCTTCATCC CHR5 Serisi 79950780 CHR5:79950480-79951080 CGCCGCACATAGTAGGTTCT CTTCCTCCTC (Mali İşler)CAGCCCTATC 79951495 CHR5:79951195-79951795 CTTGGGTCACCTGCACAGTA (Türkçe) ATTTTGAAGCACCCAAGCTG CHR1 237048499 chr1:237048199-237048799 GTCAAAGGCCAGTCCCTTCT CTCCCTTCACCAACTGTGCT CHR8 63938763 CHR8:63938463-63939063 CAGTGAAGTTCAGCGGCAT TATTTTCCTGTGTGGGGCAC (İngilizce) CHR21 Serisi 46934825 CHR21:46934525-46935125 CCAACCTGAG (CCAACCTGAG)ATGGCTTTTC TCCTTGGTGCTCTTGCTTTT Tablo 1: Beş gende seçilen yedi SNP için kullanılan primerler. Bu sayfa, mide kanserinde 5-FU direnci ile ilişkili SNP’lerin primerlerinin yeri hakkındaki bilgileri gösterir. Sıcaklık Saat Hayır. döngü sayısı 99 °C 2 dk 1 döngü 99 °C 15 saniye 22 döngü 60 °C 4 dk 10 °C Tutmak 1 döngü Tablo 2: DNA amplifikasyonu için termal döngü programı. Sıcaklık, zaman ve döngüler gibi termal reaksiyon koşulları gösterilir. Adım Sıcaklık Saat Hayır. döngü sayısı Enzimleri aktive edin 99 °C 2 dk 1 döngü Denatüre Etme 99 °C 15 saniye 30 döngü Tavlama ve uzatma 60 °C 4 dk Korumak 10 °C Tutmak 1 döngü Tablo 3: cDNA amplifikasyonu için termal döngü programı. Sıcaklık, zaman ve döngüler gibi termal reaksiyon koşulları gösterilir. Sıcaklık Saat Hayır. döngü sayısı 50 °C 10 dk 1 döngü 55 °C 10 dk 1 döngü 60 °C 20 dk 1 döngü 10 °C Tutmak 1 döngü Tablo 4: Astar dizisinin sindirimi için termal döngü programı. Sıcaklık, zaman ve döngüler gibi termal reaksiyon koşulları gösterilir. Parça Hacim P1 adaptörü 1,5 μL Özel adaptör X 1,5 μL Nükleaz içermeyen su 3 μL Reaksiyon sisteminin toplam hacmi 6 μL X: Belirli adaptör numarasını gösterir Tablo 5: Adaptör karışımının hazırlanması için reaktif ekleme sırası. Reaktifleri burada verilen sırayla tüpe ekleyin. Parça Hacim Tampon bağlanıyor 4 μL Adaptör karışımı X 2 μL DNA ligaz 2 μL Reaksiyon sisteminin toplam hacmi 30 μL Tablo 6: Sindirilmiş astar üretimine reaktif ekleme sırası. Reaktifleri burada verilen sırayla tüpe ekleyin. Sıcaklık Saat Hayır. döngü sayısı 22 °C 30 dk 1 döngü 72 °C 10 dk 1 döngü 10 °C Tutmak 1 döngü Tablo 7: Adaptörü DNA’ya bağlamak için termal döngü programı. Sıcaklık, zaman ve döngüler gibi termal reaksiyon koşulları gösterilir. Sıcaklık Saat Hayır. döngü sayısı 22 °C 30 dk 1 döngü 68 °C 5 dk 1 döngü 72 °C 5 dk 1 döngü 10 °C Tutmak 1 döngü Tablo 8: Adaptörü cDNA’ya bağlamak için termal döngü programı. Sıcaklık, zaman ve döngüler gibi termal reaksiyon koşulları gösterilir. Parça Hacim Kütüphane amplifikasyonunun reaksiyon çözümü 50 μL Kütüphane astar karışımı 2 μL Reaksiyon sisteminin toplam hacmi 52 μL Tablo 9: Amplifikasyon reaktifleri ekleme sırası. Reaktifleri burada verilen sırayla tüpe ekleyin. Sıcaklık Saat Hayır. döngü sayısı 98 °C 2 dk 1 döngü 98 °C 15 saniye 5 döngü 60 °C 1 dk 10 °C Tutmak 1 döngü Tablo 10: DNA kütüphanesini çoğaltmak için termal döngü programı. Sıcaklık, zaman ve döngüler gibi termal reaksiyon koşulları gösterilir. Sıcaklık Saat Hayır. döngü sayısı 98 °C 2 dk 1 döngü 98 °C 15 saniye 5 döngü 64 °C 1 dk 10 °C Tutmak 1 döngü Tablo 11: cDNA kitaplığını amplifiye etmek için termal döngü programı. Sıcaklık, zaman ve döngüler gibi termal reaksiyon koşulları gösterilir. rs1801131 rs1801133 rs1650697 RS442767 Serisi rs1805087 rs11545078 RS1051298 Serisi Ref T G A G A G G Alt G A G T G A A Func.refGeneWithVer ekzonik ekzonik UTR5 Serisi Ters yön -de ekzonik ekzonik UTR3 (İngilizce) Gene.ref (İngilizce)GeneWithVer MTHFR (Türkçe) MTHFR (Türkçe) DHFR (DHFR) DHFR (DHFR) MTR GGH (İngilizce) SLC19A1 Gen Detay.refGeneWithVer . . NG_023304.1:g.5020T>G . . . NM_001205206.1:c.*64C>T;NM_001205207.1:c.*746C>T;NM_194255.2:c’dir.*746C>T Exonic Func (Ekzonik Func).refGeneWithVer eşanlamlı olmayan;SNV (SNV) eşanlamlı olmayan;SNV (SNV) . . eşanlamlı olmayan;SNV (SNV) eşanlamlı olmayan;SNV (SNV) . AAChange.refGeneWithVer MTHFR:NM_001330358.1:dışn8:c.A1409C:s.E470A; MTHFR:NM_005957.4:ekson8:c.A1286C: p.E429A MTHFR:NM_001330358.1:dışn5:c.C788T:s.A263V; MTHFR:NM_005957.4:exon5:c.C665T:sayfa A222V . . MTR:NM_001291939.1:ekson25:c.A2603G:s.D868G; MTR:NM_001291940.1:ekson25:c.A1535G: PD512G;MTR:NM_000254.2:ekson26:c’dir.A2756G:p.D919G Teknolojisi GGH:NM_003878.2:ekson5:c.C452T:p.T151I Jin cytoBand (Sito Bandı) 1p36.22 1p36.22 5Ç14,1 5Ç14,1 1q43 8Ç12.3 21Ç22,3 Tablo 12: SNP’lerin ilgili bilgileri. ANNOVAR kullanarak örneklere açıklama ekleme. MTHFR (Türkçe) DHFR (DHFR) MTR GGH (İngilizce) SLC19A1 rs1801131 rs1801133 rs1650697 RS442767 Serisi rs1805087 rs11545078 RS1051298 Serisi 1000g2015aug_all 0.249401 0.245407 0.76857 0.290136 0.218251 0.085463 0.524361 1000g2015aug_afr 0.1513 0.09 0.9349 0.0318 0.2844 0.056 0.5772 1000g2015aug_amr 0.1513 0.4741 0.755 0.3991 0.1772 0.0403 0.4323 1000g2015aug_eas 0.2192 0.2956 0.6607 0.5853 0.1052 0.0873 0.5635 1000g2015aug_eur 0.3131 0.3648 0.7555 0.3191 0.173 0.0924 0.4493 1000g2015aug_sas 0.4172 0.1186 0.6779 0.228 0.3211 0.1483 0.5552 Tablo 13: 1000 Genom Projesindeki SNP’lerin filtre tabanlı açıklaması. MTHFR (Türkçe) DHFR (DHFR) MTR GGH (İngilizce) SLC19A1 rs1801131 rs1801133 rs1650697 RS442767 Serisi rs1805087 rs11545078 RS1051298 Serisi ExAC_ALL 0.295 0.3037 . . 0.2091 0.0936 . ExAC_AFR 0.1588 0.1124 . . 0.2666 0.0545 . ExAC_AMR 0.1555 0.5141 . . 0.1864 0.0361 . ExAC_EAS 0.2148 0.3052 . . 0.1132 0.0824 . ExAC_FIN 0.3128 0.2227 . . 0.1892 0.0581 . ExAC_NFE 0.3191 0.345 . . 0.1919 0.0969 . ExAC_OTH 0.304 0.3062 . . 0.2108 0.0973 . ExAC_SAS 0.4153 0.1409 . . 0.316 0.165 . Tablo 14: Ekzom Agregasyon Konsorsiyumu’ndaki SNP’lerin filtre tabanlı ek açıklaması. Ek Tablo 1: DNA amplifikasyonu için reaktif ekleme sırası. Reaktifleri burada verilen sırayla tüpe ekleyin. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Tablo 2: cDNA amplifikasyonu için reaktif ekleme sırası. Reaktifleri burada verilen sırayla tüpe ekleyin. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Tablo 3: Klinik örnek dizileme sonuçlarına örnek. Sadece örneklerde bulunan mutasyonlar belgelere kaydedilecektir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Klinik uzmanlar, aynı tip ve evrede mide kanseri olan hastaların bile, aynı tedavi yaklaşımına belirgin şekilde farklı yanıtlar verebileceği konusunda hemfikirdir. Yıllarca süren araştırmalar, bilim adamlarına, bireysel varyasyonların esas olarak mide kanserinin heterojen, polimorfik ve çeşitli şekilde farklılaşmış bir hücresel popülasyon olarak doğasına atfedildiğini ve tedavi yanıtlarında önemli bireysel eşitsizliklere yol açtığını ortaya koymuştur28. Sonuç olarak, mide kanseri örneklerinin üst gastrointestinal endoskopi veya cerrahi yoluyla alınması ve kan örneklerinin alınması, genetik analiz için yüksek verimli dizileme ile birleştiğinde, kişiselleştirilmiş mide kanseri tedavisine olanak tanır. Bu strateji, klinik tedavi etkinliğini artırmak ve ciddi toksik yan etki riskini azaltmak için tasarlanmıştır. İyon yarı iletken dizileme teknolojisindeki ilerleme, kişiselleştirilmiş tedaviyi pratik bir gerçekliğe dönüştürmüştür29.

İşte bu test yönteminin bazı sınırlamaları. Burada kullanılan kit esas olarak in vitro tanı içindir, bu nedenle MTHFR geninin rs1801131 ve rs1801133, DHFR geninin rs1650697 ve rs442767, MTR geninin rs1805087, GGH geninin rs11545078 ve SLC19A1’nin rs1051298 mutasyonunu tespit etmekle sınırlıdır. Diğer bölümlerdeki mutasyon tespit edilemez. Tümör dokusundaki önemli heterojenlik nedeniyle, farklı örnekleme konumları tespit sonuçlarını etkileyebilir. Daha uzun süre saklanan parafine gömülü doku örnekleri için, DNA ve RNA, test sonuçlarını etkileyerek belirli bir dereceye kadar bozulabilir. Makul olmayan numune toplama, taşıma ve işlemenin yanı sıra uygun olmayan deneysel çalışma ve deney ortamı yanlış negatif veya yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Nükleik asit konsantrasyonu 2 ng/μL’den düşükse tespit sonucu garanti edilemez. Kitin test sonuçları sadece klinik referans içindir. Hastalar için kişiselleştirilmiş tedavi seçimi, semptomları/bulguları, tıbbi geçmişleri, diğer laboratuvar testleri ve tedavi reaksiyonları ile birlikte düşünülmelidir. Negatif sonuçlar, hedef gen mutasyonunun varlığını tamamen dışlayamaz. Negatif sonuçlar, numunedeki çok az tümör hücresinden, nükleik asidin aşırı bozulmasından veya amplifikasyon reaksiyon sistemindeki hedef gen konsantrasyonunun tespit sınırının altına düşmesinden de kaynaklanabilir.

Kullanılan kitin bazı performans indeksleri anlatıldığı gibidir. Analitik duyarlılık: DNA örnekleri için, bu kitteki toplam nükleik asidin minimum tespit edilebilir miktarı 10 ng’dir ve %5 mutasyon oranı tespit edilebilir. RNA örnekleri için, bu kitteki toplam nükleik asidin minimum tespit edilebilir miktarı 10 ng’dir. Pozitif ve negatif tesadüf oranı: Pozitif ve negatif tesadüf oranı %100’e ulaşır. Algılama sınırı (LOD): L1-L14 olarak numaralandırılmış toplam 14 LOD referansı kullanılabilir. L1-L11, MTHFR, DHFR, MTR, GGH ve SLC19A1 genlerinin LOD referanslarıdır ve tespit sonuçları, karşılık gelen gen bölgelerinin mutasyon tiplerinin pozitif olduğu ve tesadüf oranlarının %100 olduğu olmalıdır. Tekrarlanabilirlik: R1-R5 olarak numaralandırılmış toplam beş tekrarlayan referans materyali kullanılabilir. R1, güçlü bir pozitif tekrarlayan referans materyalidir ( DPYD geninin rs67376798 mutasyonu). Bu mutasyonu daha az sayıda içeren R2, zayıf pozitif tekrarlayıcı bir referans materyalidir ( DPYD geninin rs67376798 mutasyonu), R3 negatif tekrarlayıcı bir referans materyalidir ( DPYD, MTHFR ve ABCB1 genlerinin 6 bölgesi vahşi tip olarak tespit edilir). Her bir referans numunesi 10 kez test edilmeli ve bu tekrarlanan değerlendirmelerin sonuçlarının önceden tanımlanmış sınıflandırmalarına uygun olduğundan emin olunmalıdır. Veri hacmi: DNA ve RNA örneklerinin etkin veri hacmi 0,05 M’nin üzerinde kontrol edilmelidir. DNA örneklerinin dizileme derinliği 500’ün üzerinde kontrol edilecek ve RNA örneklerinin Haritalanmış Okumaları 20000’in üzerinde kontrol edilecektir. Girişim testi: Bu kit, endojen girişim maddelerinden (trigliseritler ve albümin) ve eksojen girişim maddelerinden (formalin ve susuz alkol) etkilenmez.

Deney sırasında bazı önlemlere dikkat edilmelidir. Burada kullanılan kit sadece in vitro test için kullanılabilir. Lütfen deneyden önce bu kılavuzu dikkatlice okuyunuz ve geçerlilik süresi içinde kullanınız. Kitin farklı partilerdeki bileşenleri birbirinin yerine kullanılamaz. Kontaminasyonu önlemek için bu kit için tek kullanımlık sarf malzemelerinin kullanılması tavsiye edilir. Bu kitin kullanımı sırasında, filtre elemanlı bir emme başlığı kullanılması tavsiye edilir. Numunede herhangi bir potansiyel biyolojik tehlikeden kaçınmak için, test numunesi cilt ve mukoza zarı ile temasını önlemek için bulaşıcı maddeler olarak kabul edilmelidir. Numunelerin, aerosollerin dışarı akışını önleyebilecek bir biyogüvenlik kabininde kullanılması önerilir. Operasyonda kullanılan test tüpleri ve emiciler atılmadan önce sterilize edilmelidir. Numunelerin işletilmesi ve imhası, ilgili yasa ve yönetmeliklerin gerekliliklerini karşılamalıdır: Sağlık Bakanlığı Mikrobiyal Biyomedikal Laboratuvarların Biyogüvenliği ve Tıbbi Atık Yönetimi Yönetmeliği30,31. Deney personeli mesleki eğitim almalı, talimatlara sıkı sıkıya bağlı olarak çalışmalı ve alanları deney sürecine göre sıkı bir şekilde ayırmalıdır. Deney işleminin her aşamasında özel alet ve ekipmanlar kullanılacak ve her alanın her aşamasındaki eşyalar birbirinin yerine kullanılmayacaktır. Deney personeli, deney sürecine göre alanları kesinlikle ayırmalıdır. Deney işleminin her aşamasında özel alet ve ekipmanlar kullanılacaktır. Eldiven, iş elbisesi vb. gibi gerektiğinde koruyucu önlemler alın. Atık bertarafı, ilgili ulusal yönetmeliklere uygun olacaktır.

Bu makalenin odak noktası mide kanseri ile ilgili beş gen içindeki yedi SNP üzerinde olmasına rağmen, pratik uygulamalardaki dizileme sadece bu beş genle sınırlı değildir. Bu makale, mide kanserinde yedi SNP ile 5-FU kemoterapiye duyarlılık arasında anlamlı bir korelasyon olduğunu kesin olarak ortaya koymaktadır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenen Mide Kanseri Hücresinin Apatinib Kaynaklı Ferroptoza Direncinde ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL Yolunun Mekanizmasının ve Rolünün Araştırılması (Madde numarası: 82172814) tarafından desteklenmektedir; Guangdong İl Temel ve Uygulamalı Araştırmaların Finansmanı Komitesi tarafından desteklenen Çoklu Doymamış Eter Fosfolipid Yolu (Ürün numarası: 2022A1515010267) Yoluyla Apatinib Tarafından İndüklenen Ferroptoza Mide Kanseri Hücre Direncinin Modüle Edilmesinde Çinko Parmak Transkripsiyon Faktörü 1’in Rolünün ve Mekanizmasının Araştırılması; ve Mide Kanseri için 5-FU Kemosensitivite Tanısı için Reaktifin Araştırılması ve Uygulanması (Ürün numarası: 201903010072), Guangzhou’daki Bilim ve Teknoloji Projeleri.

Materials

1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
Amplification primer of gastric cancer Thermo Fisher The primers are sythesized by Thermo Fshier according to the sequence in Table 1.
Deparaffinization Qiagen 19093
DNA purification magnetic beads Bechkman A63881
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent
Factory Thermo Fisher Scientific		 http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher 4480441
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Pipette tips  Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
PureLink RNA Mini Columns Thermo Fisher A29839
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit Thermo Fisher AM1975
Tabletop mini centrifuge SCILOGES S1010E
Thermal Cycler Life Technologies 4375786
Ultramicro nucleic acid analyzer BEIJING ORIENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT LTD. BD-1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8, (2017).
  3. Shah, M. A., et al. Immunotherapy and targeted therapy for advanced gastroesophageal cancer: Asco guideline. J Clin Oncol. 41 (7), 1470-1491 (2023).
  4. Loganayagam, A., et al. Pharmacogenetic variants in the dpyd, tyms, cda and mthfr genes are clinically significant predictors of fluoropyrimidine toxicity. Br J Cancer. 108 (12), 2505-2515 (2013).
  5. Giacchetti, S., et al. Phase iii multicenter randomized trial of oxaliplatin added to chronomodulated fluorouracil-leucovorin as first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 18 (1), 136-147 (2000).
  6. Hoff, P. M., et al. Comparison of oral capecitabine versus intravenous fluorouracil plus leucovorin as first-line treatment in 605 patients with metastatic colorectal cancer: Results of a randomized phase iii study. J Clin Oncol. 19 (8), 2282-2292 (2001).
  7. Meulendijks, D., et al. Clinical relevance of dpyd variants c.1679t>g, c.1236g>a/hapb3, and c.1601g>a as predictors of severe fluoropyrimidine-associated toxicity: A systematic review and meta-analysis of individual patient data. Lancet Oncol. 16 (16), 1639-1650 (2015).
  8. Sadighi, S., Mohagheghi, M. A., Montazeri, A., Sadighi, Z. Quality of life in patients with advanced gastric cancer: A randomized trial comparing docetaxel, cisplatin, 5-fu (tcf) with epirubicin, cisplatin, 5-fu (ecf). BMC Cancer. 6, 274 (2006).
  9. Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
  10. Ladner, R. D. The role of dutpase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy. Curr Protein Pept Sci. 2 (4), 361-370 (2001).
  11. Capitain, O., et al. The influence of fluorouracil outcome parameters on tolerance and efficacy in patients with advanced colorectal cancer. Pharmacogenomics J. 8 (4), 256-267 (2008).
  12. Askari, B. S., Krajinovic, M. Dihydrofolate reductase gene variations in susceptibility to disease and treatment outcomes. Curr Genomics. 11 (8), 578-583 (2010).
  13. Ceppi, F., et al. DNA variants in dhfr gene and response to treatment in children with childhood b all: Revisited in aieop-bfm protocol. Pharmacogenomics. 19 (2), 105-112 (2018).
  14. Sharp, L., Little, J. Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and colorectal neoplasia: A huge review. Am J Epidemiol. 159 (5), 423-443 (2004).
  15. Yousef, A. M., et al. The association of polymorphisms in folate-metabolizing genes with response to adjuvant chemotherapy of colorectal cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 82 (2), 237-243 (2018).
  16. Schneider, E., Ryan, T. J. Gamma-glutamyl hydrolase and drug resistance. Clin Chim Acta. 374 (1-2), 25-32 (2006).
  17. Moran, R. G. Roles of folylpoly-gamma-glutamate synthetase in therapeutics with tetrahydrofolate antimetabolites: An overview. Semin Oncol. 26 (2), 24-32 (1999).
  18. Maezawa, Y., et al. High gamma-glutamyl hydrolase and low folylpolyglutamate synthetase expression as prognostic biomarkers in patients with locally advanced gastric cancer who were administrated postoperative adjuvant chemotherapy with s-1. J Cancer Res Clin Oncol. 146 (1), 75-86 (2020).
  19. Cheng, Q., et al. A substrate specific functional polymorphism of human gamma-glutamyl hydrolase alters catalytic activity and methotrexate polyglutamate accumulation in acute lymphoblastic leukaemia cells. Pharmacogenetics. 14 (8), 557-567 (2004).
  20. Zhang, Q., et al. Recognition of cyclic dinucleotides and folates by human slc19a1. Nature. 612 (7938), 170-176 (2022).
  21. Ulrich, C. M., et al. Polymorphisms in folate-metabolizing enzymes and response to 5-fluorouracil among patients with stage ii or iii rectal cancer (int-0144; swog 9304). Cancer. 120 (21), 3329-3337 (2014).
  22. Zhang, X., et al. Discovery of novel biomarkers of therapeutic responses in han chinese pemetrexed-based treated advanced nsclc patients. Front Pharmacol. 10, 944 (2019).
  23. Corrigan, A., et al. Pharmacogenetics of pemetrexed combination therapy in lung cancer: Pathway analysis reveals novel toxicity associations. Pharmacogenomics J. 14 (5), 411-417 (2014).
  24. Ion 520 & ion 530 ext kit – chef user guide. Thermofisherscientific Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf (2023)
  25. Ion genestudio s5 instrument user guide. Thermofisherscientific Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf (2023)
  26. Parkin, N. T., et al. Multi-laboratory comparison of next-generation to sanger-based sequencing for hiv-1 drug resistance genotyping. Viruses. 12 (7), 694 (2020).
  27. Ziller, M. J., Hansen, K. D., Meissner, A., Aryee, M. J. Coverage recommendations for methylation analysis by whole-genome bisulfite sequencing. Nat Methods. 12 (3), 230-232 (2015).
  28. Lordick, F., et al. Unmet needs and challenges in gastric cancer: The way forward. Cancer Treat Rev. 40 (6), 692-700 (2014).
  29. Kumar, K. R., Cowley, M. J., Davis, R. L. Next-generation sequencing and emerging technologies. Semin Thromb Hemost. 45 (7), 661-673 (2019).
  30. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. Ministry of Health of the People’s Republic of China. WS 233-2002. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. , 1-64 (2002).
  31. China Environmental Protection Industry. Medical waste management regulations. China Environmental Protection Industry. (1), 6-10 (2004).

Tags

Gastric CancerSingle Nucleotide PolymorphismsSNPs5-fluorouracil5-FUPharmacogeneticsMTHFRDHFRMTRGGHSLC19A1Ion Semiconductor SequencingNext-generation Sequencing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, K., Yan, X., Huang, Z., Liang, H., Li, Z., Wang, M., Wan, Y., Wang, S., Zhao, L. Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (207), e66058, doi:10.3791/66058 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image