İlkel Germ Hücresi Kriyoprezervasyonu ve Drosophila Suşlarının Canlanması

1. Ekipman hazırlığı Mikromanipülatör sistemi: Hücreleri toplamak ve nakletmek için bir mikromanipülatör sistemi kurun (Şekil 1A). PGC-toplama cam slaytları (Şekil 2A)Heptan tutkalı hazırlamak için yaklaşık 30 cm uzunluğunda çift taraflı bant kesin ve gece boyunca 7 mL teknik (normal) dereceli heptan çözeltisine batırın. Bir cam slaytın arkasına embriyo hizalaması için iki paralel referans çizgisi çizin. Yukarıdaki heptan yapıştırıcı damlalarını bir Pasteur pipeti kullanarak cam slayt üzerine (çizgiler olmadan yan tarafta) yayın. Sürgünün yüzeyini beyaz olana kadar havayla kurutun. Heptan tutkal damlalarının eklenmesini ve yayılmasını tekrarlayın ve slaydı tekrar kurutun.NOT: Yapıştırıcı, sıvı çözeltilerin düz yüzeye yayılmasını önler ve sulu çözeltilerin bir iğneye yüklenmesini kolaylaştırır. Embriyo havuzu çerçeveleri yapmak için, bir kesme tahtası üzerine elektrik bandı gibi üç kat 0,2 mm kalınlığında standart vinil bant yapıştırın. Bandı 1,5 cm genişliğinde dikdörtgenler halinde kesin. Ardından, 2 ila 3 mm’lik bir çerçeve bırakarak üç bant katmanını da kesin.NOT: Embriyolar hizalandıktan sonra, embriyolar için bir havuz oluşturmak üzere bir embriyo havuzu çerçevesi yapıştırılır. Transplantasyon iğneleriNOT: Bu çalışma sırasında piyasada bulunan tüm iğneler, PGC kriyoprezervasyonu için çok dar veya çok genişti.Bir cam kılcal damar ve bir çektirme kullanarak bir iğne yapın. Isıtıcı seviyesi 85.0-98.4, mıknatıs ana seviyesi 57.8 ve mıknatıs alt seviyesi 45.0 olan bir NARISHIGE PN-31 çektirme kullanıyoruz. Yaklaşık duvar kalınlığı 1 μm ve ucu yaklaşık 200 μm olan, iç çapı 10-12 μm olan bir iğne yapmak için, iğne ucunu aşağıdaki üç aşamalı işlemde parlatın (Şekil 3). İlk olarak, iğne ucunu, ucun iç çapı 10-12 μm olana kadar 780 rpm hızında 30°’lik bir açıyla zımparalayın. Bu ilk taşlama adımı yaklaşık 1 saat sürer.NOT: İğne ucunun kırılmasını önlemek için önce bileme taşını döndürün ve ardından iğneyi yavaşça bileme taşının üzerine doğru hareket ettirin. İstenilen açıyı izlemek için iğnenin üstüne bir çizgi çizin. İğneyi saat yönünün tersine 90° döndürün ve 180 rpm hızında tekrar parlatın. Bu işlem yaklaşık 5 dakika sürer. İğneyi saat yönünde 45° döndürün ve bir saniye boyunca 180 rpm hızında parlatın. Mikroskop tablasına bir damla kromik asit karışımı (DİKKAT: toksik) içeren bir toplama camı lamı yerleştirin. İğneyi kılcal tutucuya (Şekil 1D) kaydırma yüzeyine göre 10°-13° açıyla takın, iğneyi dikkatlice aşağı doğru hareket ettirin ve ucu kromik asit karışımına daldırın. Pistonu çekerek ve iterek (Şekil 1B), iğnedeki cam kalıntılarını gidermek için çözeltiyi iğneden birkaç kez mekanik olarak yükleyin ve boşaltın. Dış duvarı da temizlediğinizden emin olun. Kromik asidi tamamen çıkarmak için iğnenin içini ve dışını iki kez damıtılmış suyla yıkayın. 2. PGC’lerin toplanması ve dondurularak saklanması Embriyoların toplanmasıİlgilenilen donör suşunun uygun sayıda sineğini (embriyo toplama kabı için her cinsiyet için yaklaşık 450) bir embriyo toplama plakası (Şekil 1E) ile bir embriyo toplama kabına aktarın ve 25 ° C’de inkübe edin. Genellikle oda sıcaklığında (23-25 °C) daha az kalabalık koşullarda yetiştirilen 3-5 günlük ebeveyn sinekleri kullanıyoruz. İki adet 30 dakikalık ön toplama yapın ve bırakılan yumurtaları atın. Dişiler yumurta kanalında gelişen döllenmiş yumurtaları tutabildiklerinden, bu adım adım 2.1.3’te yumurtlamayı senkronize etmek için gereklidir (Şekil 4). İki ön toplamadan sonra, embriyoları 50 dakika boyunca toplayın ve daha sonra embriyoların blastoderm aşamasına (erken evre 5,17) gelişmesine izin vermek için toplanan embriyoları 25 ° C’de nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. Kuluçka süresi genellikle 100 dakikadır, ancak suşa bağlı olarak 120 dakikaya kadar uzatılabilir (Şekil 4).NOT: Nemlendirilmiş bir oda, plastik bir kutunun altına nemli bir kağıt havlu yerleştirilerek ve kullanımdan önce üzerine bir su sisi püskürtülerek yapılır. Erken evre-5 embriyolarda PGC oluşumu tamamlanmıştır ancak somatik hücreselleşme tamamlanmamıştır. Bir embriyonun tam aşaması, adım 2.4’te bir bileşik mikroskop altında belirlenir. Dekoryonlayıcı embriyolarPaslanmaz çelik hasır süzgecin üzerine bir damla damıtılmış su bırakın (150 göz, 109 μm açıklık, 60 μm tel çapı; Şekil 1F). Forseps kullanarak, embriyo toplama plakasından embriyoları toplayın ve su damlacığına koyun. Suyu emmek için kağıt mendili alttan süzgecin üzerine bastırın. Embriyolara taze% 5 (Cl olarak) sodyum hipoklorit çözeltisi damlacıkları ekleyin ve süzgeci 10 saniye boyunca sürekli olarak hafifçe vurun. Embriyoları doğrudan damıtılmış su ile sıçratarak yıkayın ve suyu emmesi için kağıt mendili alttan süzgecin üzerine bastırın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. Dekoryonlu embriyoların hizalanmasıStereo mikroskop altında, embriyoları transfer etmek için forseps kullanın. Dekoryonlu embriyoları iki referans çizgisi boyunca bir PGC toplama cam slaytı üzerinde iki sıra halinde hizalayın (Şekil 2A). Embriyolar, önleri sağa (manipüle edilecek taraf) ve ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirilir.NOT: Bu adım, genellikle yaklaşık 40 embriyoyu hizaladığımız 20 dakika içinde tamamlanmalıdır. PGC toplama cam slaytındaki embriyoların etrafına bir embriyo havuzu çerçevesi yapıştırın. 1 μL CPA solüsyonu (1x Ephrussi-Beadle Ringer solüsyonu, EBR, etilen glikol ve 1 M sükroz içerir; 1x EBR: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 ve pH 6.9’da 10 mM Hepe) çerçevenin çevrelediği alanda iki ayrı noktaya damlatın ve embriyoların kurumasını önlemek için havuzu silikon yağı ile doldurun (Şekil 2A).NOT: CPA çözeltisini hazırlamak için, 10.26 g sakarozu, 3 mL 10 x EBR çözeltisi içeren yaklaşık 20 mL damıtılmışH2Oiçinde tamamen çözün. 6 mL etilen glikol ekleyin ve ardından 30 mL’ye kadar damıtılmışH2Oekleyin. İyice karıştırdıktan sonra, çözeltiyi 0,22 mm’lik tek kullanımlık bir membrandan süzün. PGC’lerin ToplanmasıAdım 2.3.2’deki PGC toplama cam lamını, mikromanipülatör sistemi ile donatılmış bir mikroskobun tablasına yerleştirin. İğneyi kılcal damar tutucuya takın ve sol sıradaki ilk embriyoyu ve iğne ucunu aynı odak düzlemine getirin. Silikon yağını iğneye 2-3 saniye yükleyin. Sol sıradaki embriyolardan PGC toplamaya başlayın. 20x objektif lens kullanarak, iğne ucunu yavaşça embriyonun ön ucunun yüzeyine doğru hareket ettirin ve iğneyi hareket ettirerek değil, mikroskop aşamasını hareket ettirerek embriyoyu arka uca doğru nüfuz ettirin. İğne ucu arka uca ulaştığında, iğneyi hafifçe geri çekin ve somatik hücre tabakasının hemen içindeki iğnedeki yumurta sarısını tamamen boşaltın. İğnedeki basıncı sabit tutarken, iğne ucunu arka kutbun hemen içindeki PGC’lere doğru hareket ettirin ve nazikçe, ancak fazla zaman harcamadan PGC’leri yükleyin. İğneyi embriyodan hızlı bir şekilde çekin ve yumurta sarısı ve diğer kirleticileri iğneden silikon yağ havuzuna boşaltın, PGC’leri iğnede tutun. Ardından, havuzdan temiz silikon yağı yükleyin. Sol sıradaki diğer embriyolar için 2.4.2’den 2.4.5’e kadar olan adımları tekrarlayın. Yeni bir embriyodan PGC’leri toplamadan önce, yüklü PGC’leri iğnede tutarken, adım 2.4.5’te yüklenen silikon yağının mümkün olduğunca çoğunu somatik hücre tabakasının içine bırakın. Bu, yeni yüklenen PGC’lerin, aralarında herhangi bir müdahale malzemesi olmadan daha önce toplanan PGC’lere bitişik olmasını sağlar. Sol sıradaki embriyolardan PGC toplama işlemini tamamladıktan sonra, PGC’leri yumurta sarısı ve diğer kirleticilerden mümkün olduğunca ayırın. Bunu başarmak için, iğnedeki tüm PGC’leri bir embriyonun yüzeyine bırakın ve yumurta sarısını veya diğer kirleticileri başka bir komşu embriyoya çıkarın. Ardından, sağ sıradaki embriyolardan PGC’leri toplayın. Sağ ve sol sıralardan toplanan PGC’leri birleştirin. PGC’lere kriyoprotektif ajan (CPA) uygulanmasıİğneyi bir damlada CPA ile yıkadıktan sonra, başka bir damlada taze CPA’yı iğneye yükleyin ve embriyo üzerinde biriken PGC’lere CPA ekleyin. EBM’nin hacmi, PGC’lerinkine eşit olmalıdır. CPA’nın eklenmesinden 1-2 saniye sonra PGC kümesinden mümkün olduğunca fazla CPA’yı kaldırın. PGC’ler hafifçe küçülür ve EBM eklendikten hemen sonra kare şeklinde olur. İğneyi boşaltın ve ardından silikon yağını 5 sn veya daha uzun süre yükleyin. Toplanan tüm PGC’leri yükleyin ve ardından silikon yağını bir kez daha 5 sn veya daha uzun süre yükleyin. PGC’ler artık iki silikon yağı tabakası arasına sıkıştırılmıştır (Şekil 2B).NOT: Mümkün olduğunca çok yumurta sarısı, CPA ve diğer kirleticilerin çıkarılması önemlidir. Kriyoprezervasyon PGC’lerÜç vanayı açın (Şekil 1C) ve ardından iğneyi mikromanipülatörden ayırın. İğnenin yüzeyindeki yağı yumuşak kağıt mendille kurulayın. İğnenin ucuna doğrudan dokuya dokunmayın. İğneyi bir iğne tutucuya takın ve vinil bant kullanarak tabandaki yerine kilitleyin (Şekil 1H). Tutucu boruya bir etiket yapıştırın. Flaş, tutucuyu iğne aşağı bakacak şekilde sıvı nitrojene batırarak dondurun. Sıvının raftan çıkması durana kadar tutucuyu serbest bırakmayın. Tutucuyu buhar fazı alanında değil, sıvı faz alanındaki bir sıvı nitrojen depolama tankında saklayın. 3. PGC’lerin çözülmesi ve nakledilmesi Agametik konakçı sineklerden embriyoların toplanması, dekoryonlanması ve hizalanması2. adımı izleyerek agametik konakçı sineklerden embriyoları toplayın ve dekoryonatın. Evre 5 agametik konakçı embriyoları bir transplantasyon cam lamı üzerinde hizalayın. Ancak bu sefer posterioru sağa (manipüle edilecek taraf) ve ventrali üste doğru yönlendirin (Şekil 5). Yaklaşık 30 embriyoyu 20 dakikada iki sıra halinde sıralayın. Embriyoları hizalarken, oda nemi gerektiriyorsa 2-10 dakika boyunca bir nemlendirici çalıştırın (Tablo 1). İdeal nem ila ‘tır, ancak bu termal koşullara bağlı olarak değişebilir. Konakçı embriyolarda PGC’lerin çözülmesi ve nakliDondurularak saklanmış PGC’leri hızlı bir şekilde çözmek için, iğneyi içeren tutucuyu, iğne aşağı bakacak şekilde oda sıcaklığında 1x EBR çözeltisine kaydırın ve 10 saniye boyunca su altında tutun. Transplantasyon cam lamını mikroskop tablasına yerleştirin. Dondurularak çözülmüş iğneyi kılcal damar tutucuya takın ve sol sıradaki ilk embriyoyu ve iğne ucunu aynı odak düzlemine getirin. 20x objektif lens kullanarak, iğne ucunu yavaşça embriyonun arka ucunun yüzeyine doğru hareket ettirin. Her embriyonun dışını nazikçe dürtün ve yavaşça orijinal şekillerine döndüklerinden emin olun. Dürtme, embriyonun iç basıncının çok yüksek veya çok düşük olmadığını doğrulayacaktır. İğneyi yavaşça hareket ettirin ve arka kutuptan bir embriyoya nüfuz edin. Yaklaşık 10-20 PGC’yi arka kutbun hemen içine, tam olarak vitellin membranı ile embriyonun somatik hücre tabakası arasına yavaşça yerleştirin. Bunları somatik hücre tabakasına bırakmaktan kaçının. Perivitellin sıvısı embriyodan dışarı sızarsa, sızan sıvıyı iğneye emdirin ve çıkarın. İğneyi embriyodan geri çekin. Sonraki embriyolar için 3.2.5 ve 3.2.6 adımlarını tekrarlayın. 4. Embriyoların kuluçkalanması ve donör suşlarının eski haline getirilmesi Nakledilen PGC’leri almayan embriyoları çıkarın ve kalan embriyoları nemlendirilmiş bir odada (Şekil 1G) 25 °C’de inkübe edin. Transplantasyondan 24 saat veya daha uzun bir süre sonra ve yumurtadan çıktıktan sonra mümkün olan en kısa sürede, yumurtadan çıkan larvaları almak ve standart Drosophila gıda şişelerine aktarmak için forseps kullanın ve 25 ° C’de inkübe edin. Suşu canlandırmak için yeni ortaya çıkan dişileri ve erkekleri çaprazlayın (Şekil 6).NOT: Agametik konakçılar, dengeleyici kromozom suşlarına geçmeden tüm genomu bir kerede geri yüklemeyi mümkün kılar. Agametik erkeklerin bir şişede bir arada yaşaması önemli olmayacaktır çünkü dişiler, onlarla çiftleşseler bile, yeniden yaşamaya karşı azalmış duyarlılık da dahil olmak üzere uzun vadeli çiftleşme sonrası tepkiler göstermezler18,19.