الحفظ بالتبريد للخلايا الجرثومية البدائية وإحياء سلالات ذبابة الفاكهة
Summary
من المرغوب فيه للغاية اتباع طريقة طويلة الأجل للحفاظ على سلالات ذبابة الفاكهة كبديل للنقل المتكرر للذباب البالغ إلى قوارير الطعام الطازج. يصف هذا البروتوكول الحفظ بالتبريد للخلايا الجرثومية البدائية لذبابة الفاكهة وإحياء السلالة عن طريق زرعها في أجنة مضيفة غير متجانسة.
Abstract
يجب الحفاظ على سلالات ذبابة الفاكهة عن طريق النقل المتكرر للذباب البالغ إلى قوارير جديدة. هذا يحمل خطر التدهور الطفري والتغيرات المظهرية. لذلك فإن تطوير طريقة بديلة للحفظ على المدى الطويل دون مثل هذه التغييرات أمر حتمي. على الرغم من المحاولات الناجحة السابقة ، لا يزال الحفظ بالتبريد لأجنة ذبابة الفاكهة غير مفيد عمليا بسبب انخفاض قابلية التكاثر. هنا ، نصف بروتوكولا للحفظ بالتبريد للخلايا الجرثومية البدائية (PGC) وإحياء السلالة عن طريق زرع PGCs المحفوظة بالتبريد في الأجنة المضيفة لذبابة الفاكهة الميلانية (D. melanogaster). تعتبر PGCs عالية النفاذية لعوامل الحماية بالتبريد (CPAs) ، والتباين التنموي والمورفولوجي بين السلالات أقل إشكالية من الحفظ بالتبريد للأجنة. في هذه الطريقة ، يتم جمع PGCs من حوالي 30 جنينا مانحا ، ويتم تحميلها في إبرة بعد علاج CPA ، ثم يتم حفظها بالتبريد في النيتروجين السائل. لإنتاج الأمشاج المشتقة من المتبرعين، يتم إذابة الخلايا الجذعية المركزة المحفوظة بالتبريد في إبرة ثم ترسبها في حوالي 15 جنينا مضيفا أجاميا. تم تحقيق تردد لا يقل عن 15٪ من الذباب الخصب باستخدام هذا البروتوكول ، وكان عدد النسل لكل زوجين خصبين دائما أكثر من كاف لإحياء السلالة الأصلية (متوسط عدد النسل هو 77.2 ± 7.1) ، مما يشير إلى قدرة PGCs المحفوظة بالتبريد على أن تصبح خلايا جذعية جرثومية. كان متوسط عدد الذباب الخصب لكل إبرة 1.1 ± 0.2 ، و 9 من أصل 26 إبرة أنتجت ذريتين خصبتين أو أكثر. وقد وجد أن 11 إبرة تكفي لإنتاج 6 ذرية أو أكثر ، حيث من المحتمل أن يتم تضمين أنثى واحدة على الأقل ورجل واحد. يجعل المضيف agametic من الممكن إحياء السلالة بسرعة ببساطة عن طريق عبور الذباب الإناث والذكور الناشئين حديثا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن PGCs لديها القدرة على استخدامها في تطبيقات الهندسة الوراثية ، مثل تحرير الجينوم.
Introduction
إن الحفاظ على سلالات ذبابة الفاكهة عن طريق نقل الذباب البالغ إلى قوارير طعام جديدة يؤدي حتما إلى تراكم الطفرات والتغيرات اللاجينية بمرور الوقت. من الضروري تطوير طريقة بديلة للصيانة طويلة الأجل لسلالات ذبابة الفاكهة دون مثل هذه التغييرات ، خاصة بالنسبة للسلالات المرجعية التي يجب الحفاظ على الجينوم بأكمله فيها. تم وصف العديد من المحاولات الناجحة لحفظ أجنة ذبابة الفاكهة أو المبايض بالتبريد1،2،3. لسوء الحظ ، لا تزال غير ذات فائدة عملية بسبب انخفاض قابلية التكاثر. في الواقع ، تتمتع الأجنة في المراحل المبكرة بمعدل بقاء منخفض بعد الحفظ بالتبريد بسبب محتواها العالي من صفار البيض ، مما يعيق تغلغل عامل الحماية بالتبريد (CPA) وانتشاره 2,3. كما أن نفاذية CPA محدودة للغاية بسبب الطبقات الشمعية للأجنة في المرحلة المتأخرة. من الصعب ويستغرق وقتا طويلا العثور على فترة زمنية خاصة بالسلالة يكون فيها للأجنة معدل بقاء مرتفع وطبقة شمعية أرق. في الآونة الأخيرة ، قام Zhan et al.4 بتحسين طرق نفاذية الجنين ، وتحميل CPA ، والتزجيج وحفظ الأجنة بالتبريد بنجاح من سلالات متعددة. ومع ذلك ، فإن الطرق ليست سهلة التطبيق لأن صلاحية الأجنة بعد النفاذية تميل إلى أن تكون ضعيفة. ولذلك، لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من التحسين وتطوير النهج البديلة. الطرق التي تنطوي على الحفظ بالتبريد للخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) هي نهج بديل للصيانة طويلة الأجل لسلالات ذبابة الفاكهة.
تم استخدام زرع PGC (وتسمى أيضا خلية القطب) لتوليد الوهم الجرثومي ، وخاصة الإناث ، لدراسة عمليات مثل التأثيرات الأمومية للطفرات القاتلة الوزيجوتية وتحديد جنس الخلايا الجرثومية5،6،7،8،9،10،11،12. PGCs أصغر بكثير من الأجنة ومن المحتمل أن تكون عالية النفاذية لمعظم المواد الواقية بالتبريد. علاوة على ذلك ، فإن التباين التنموي والمورفولوجي بين السلالات أقل إشكالية ، والمضيف الأمامي يتيح الاستعادة السريعة للجينومات الكاملة. لقد طورنا مؤخرا طريقة جديدة للحفظ بالتبريدPGC 13 ، والتي تمنع التغيرات الجينية واللاجينية الحتمية في سلالات ذبابة الفاكهة . هنا ، نقدم البروتوكول المفصل.
تتطلب طريقة الحفظ بالتبريد هذه خبرة محددة في التعامل مع PGC والأجهزة. في حين أن النهج التدريجي قد يكون حلا فعالا لأولئك الذين ليسوا على دراية به ، فقد يكون غير مناسب للمختبرات الصغيرة بسبب متطلبات الأجهزة. يمكن تكييف بروتوكول الحفظ بالتبريد PGC هذا بسهولة أكبر للاستخدام مع أنواع مختلفة من ذبابة الفاكهة وأنواع مختلفة من الحشرات مقارنة ببروتوكولات الحفظ بالتبريد للأجنة بسبب الاختلافات التنموية والمورفولوجية الأصغر. يمكن أيضا استخدام PGCs في تطبيقات الهندسة الوراثية ، مثل تحرير الجينوم14،15،16. باختصار ، يمكن استخدام هذه الطريقة في مراكز المخزون والمختبرات الأخرى للحفاظ على سلالات الذباب والحشرات الأخرى لفترات طويلة من الزمن دون تغييرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
أحد العوامل الحاسمة للنجاح في الحفظ بالتبريد PGC وإحيائه هو استخدام أجنة جيدة. يجب استخدام الإناث الشابات (على سبيل المثال ، من 3 إلى 5 أيام) لجمع الأجنة. يتم تقييم كل من الأجنة المانحة والمضيفة عن طريق الفحص المجهري ، ويتم استخدام فقط تلك الموجودة في مرحلة البلاستوديرم (المرحلة 5)12. بالنسبة لجمع PGC ، نقوم عادة بمحاذاة ما يقرب من 40 جنينا متبرعا في فترة 20 دقيقة ونجمع PGCs من حوالي 30 جنينا في المرحلة المبكرة 5 ؛ لا يتم استخدام الأجنة القديمة والمعيبة. بعد الحفظ بالتبريد والذوبان ، يجب أن تحافظ PGCs على شكلها ؛ تمزق PGCs في الحفظ غير الناجح. يجب أن تكون الأجنة المضيفة أيضا في المرحلة 5 ولها ضغط داخلي معتدل. يجب أن تعود الأجنة ببطء إلى شكلها الأصلي بعد الحث اللطيف. لن تتطور الأجنة المجففة بشكل مفرط وغير كاف بشكل طبيعي بعد الزرع. نظرا لأن زرع PGCs من جنسين مختلفين يفشل في إنتاج الأمشاج في ذبابة الفاكهة 5,10 ، فمن المرجح أن يؤدي زرع PGCs من أجنة مانحة متعددة إلى أجنة مضيفة إلى إنتاج بالغين خصبين. تحقيقا لهذه الغاية ، نقوم عادة بجمع PGCs من حوالي 30 جنينا لكل إبرة.
كمواد واقية من البرودة ، جربنا جلايكول الإيثيلين وثنائي ميثيل سلفوكسيد والجلسرين مع السكروز بتركيزات مختلفة. قررنا EBR التي تحتوي على 20٪ جلايكول الإيثيلين والسكروز 1 M لتكون أفضل13. ومع ذلك ، فإن استخدام مواد واقية مختلفة من التبريد قد يحسن حفظ PGC22.
تتطلب طريقة الحفظ بالتبريد هذه مهارات متخصصة في التعامل مع PGC ، وهناك حاجة إلى ما يقرب من 6 أسابيع من التدريب لجمع وزرع PGCs بشكل مريح. لتقييم وتحسين الكفاءة في المهارات ، يمكن تقسيم ذلك إلى ست خطوات تدريبية: 1) محاذاة الأجنة على شريحة زجاجية ، 2) التحكم في مناور ، 3) زرع PGCs من جنين إلى جنين آخر دون الحفظ بالتبريد ، 4) زرع PGCs من 10 أجنة أو أكثر إلى 5 إلى 10 أجنة ، 5) زرع PGCs بعد تطبيق CPA ، و 6) زرع PGCs بعد ذوبان الجليد. كل خطوة قد تستغرق 1 أسبوع. الأهداف قصيرة المدى في الخطوة 3 هي معدل الفقس بنسبة 40٪ ، وقابلية بقاء الجنين إلى البالغين بنسبة 10٪ -20٪ ، وتكرار الذباب الخصب بنسبة 20٪.
يتطلب الحفظ بالتبريد PGC أجهزة مكلفة وموظفين ذوي مهارات عالية. لذلك ، قد لا يتم اعتماد هذه الطريقة من قبل العديد من المختبرات. ومع ذلك ، فإن طريقة PGC الحالية لها عدة جوانب مهمة. أولا، PGCs أصغر بكثير من الأجنة وهي شديدة النفاذية للمواد الواقية بالتبريد. في المقابل ، فإن نفاذية الحماية بالتبريد محدودة للغاية بسبب الطبقات الشمعية لأجنة ذبابة الفاكهة ، وهي أخطر مشكلة في حفظ الأجنة بالتبريد. في الواقع ، بذلت الدراسات السابقة جهودا كبيرة لإيجاد نافذة زمنية تتمتع فيها الأجنة بمعدل بقاء مرتفع وطبقة شمعية أرق. والثاني يتعلق بالتباين التنموي والمورفولوجي بين السلالات. يتم جمع PGCs من أجنة المرحلة المبكرة من 5 (2 ساعة و 30 دقيقة – 3 ساعات و 20 دقيقة بعد وضع البويضة) ، بينما يتم إجراء الحفظ بالتبريد للأجنة على أجنة المرحلة 16 (14-22 ساعة بعد وضع البيض). وبالتالي ، فإن الأجنة أقدم بكثير وتظهر تباينا أكبر بكثير في السلالة في النافذة الزمنية المثلى للحفظ بالتبريد مقارنة بالحفظ بالتبريد PGC. في الواقع ، لم يختلف تواتر المضيفين الذين ينتجون ذرية مشتقة من المانحين بين خمس سلالات درسها Asaoka et al.13 ، على الرغم من أن المضيفين لم يكونوا أجاميين. علاوة على ذلك ، فإن PGCs لديها القدرة على استخدامها في تطبيقات الهندسة الوراثية ، مثل تحرير الجينوم14،15،16.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مركز كيوتو لذبابة الفاكهة على سلالات الذباب. كما نشكر السيدة واندا مياتا على تحرير المخطوطة باللغة الإنجليزية والدكتور جيريمي ألين من Edanz (https://jp.edanz.com/ac) لتحرير مسودة هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل بمنح (JP16km0210072 ، JP17km0210146 ، JP18km0210146) من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED) إلى T.T.-S.-K. ، والمنح (JP16km0210073 ، JP17km0210147 ، JP18km0210145) من AMED إلى S.K. ، منحة (JP20km0210172) من AMED إلى T.T.-S.-K. و S.K. ، منحة مساعدة للبحث العلمي (C) (JP19K06780) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) إلى T.T.-S.-K. ، ومنحة مساعدة للبحث العلمي في المجالات المبتكرة (JP18H05552) من JSPS إلى S.K.
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
References
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genetics. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
