ショウ ジョウバエ 株の原始生殖細胞凍結保存と復活

1. 機器の準備 マイクロマニピュレーターシステム:マイクロマニピュレーターシステムを組み立てて、細胞を採取して移植します(図1A)。 PGC採取スライドガラス(図2A)ヘプタン接着剤を調製するには、長さ約30cmの両面テープをカットし、7 mLの工業用(レギュラー)グレードのヘプタン溶液に一晩浸します。 スライドガラスの背面に胚の位置合わせのために2本の平行な基準線を描きます。 上記のヘプタン接着剤をパスツールピペットを使用してスライドガラス(線のない側)に滴下します。スライドの表面が白くなるまで風乾します。 ヘプタン接着剤の滴の添加と拡散を繰り返し、スライドを再び乾かします。注意: 接着剤は、液体溶液が平らな面に広がるのを防ぎ、水溶液を針にロードしやすくします。 胎児プールのフレームを作るには、まな板に厚さ0.2mmの電気テープなどの標準的なビニールテープを3枚重ねます。テープを1.5cm幅の長方形にカットします。次に、2〜3mmのフレームを残して、3層のテープをすべて切り取ります。注:胚を整列させた後、胚プールフレームを貼り付けて、胚のプールを形成します。 移植用針注:この研究の時点で市販されているすべての針は、PGC凍結保存には狭すぎたり広すぎたりしました。ガラスの毛細管と引き手を使って針を作ります。ナリシゲPN-31のプーラーは、ヒーターレベルが85.0-98.4、マグネットメインレベルが57.8、マグネットサブレベルが45.0です。 肉厚1μm、先端約200μm、内径10〜12μmの針を作るには、次の3つの工程で針先を研磨します(図3)。まず、針先の内径が10〜12μmになるまで、針先を780rpmの速度で30°の角度で研磨します。この最初の粉砕ステップには約1時間かかります。注意: 針先が折れないように、最初に砥石を回転させてから、針を砥石の上にそっと動かします。 針の上部に線を引いて、希望の角度を追跡します。針を反時計回りに90°回転させ、180rpmの速度で再度研磨します。これには約5分かかります。 針を時計回りに45°回転させ、180rpmの速度で1秒間研磨します。 クロム酸混合物(注意:有毒)を滴下した収集スライドガラスを顕微鏡ステージに置きます。針をキャピラリーホルダー(図1D)にスライド面に対して10°〜13°の角度で取り付け、針を慎重に下に動かし、先端をクロム酸混合物に浸します。 プランジャーを引っ張ったり押したりして(図1B)、針から溶液を機械的に数回装填して排出し、針内のガラス破片を除去します。外壁も必ず掃除してください。 針の内側と外側を蒸留水で2回洗い、クロム酸を完全に取り除きます。 2. PGCの採取と凍結保存 胚の採取目的のドナー株の適切な数のハエ(胚採取カップでは雌雄ごとに約450匹)を胚採取プレート(図1E)を備えた胚採取カップに移し、25°Cでインキュベートします。 私たちは通常、室温(23〜25°C)の混雑の少ない条件下で飼育される生後3〜5日の親バエを使用します。 30分間の事前収集を2回行い、産卵した卵を捨てます。雌は卵管内で発育した受精卵を保持できるため、ステップ2.1.3の産卵を同期させるためにこのステップが必要です(図4)。 2回のプレコレクションの後、胚を50分間収集し、収集した胚を25°Cの加湿チャンバーでインキュベートして、胚を胚盤葉段階(初期段階517)に発達させます。インキュベーション時間は通常100分ですが、菌株によっては最大120分まで延長できます(図4)。注意: 加湿チャンバーは、湿らせたペーパータオルをプラスチックの箱の底に置き、使用前に水の霧を吹きかけることによって作成されます。初期段階の5胚では、PGCの形成は完了していますが、体細胞化は完了していません。胚の正確な段階は、ステップ2.4の複合顕微鏡で決定されます。 脱絨毛胚ステンレス製のメッシュストレーナー(150メッシュ、開口部109μm、線径60μm; 図1F)。鉗子を使用して、胚採取プレートから胚を採取し、水滴に入れます。 ティッシュペーパーを下からストレーナーに押し付けて水を吸収します。新鮮な5%(Clとして)次亜塩素酸ナトリウム溶液の液滴を胚に加え、ストレーナーを10秒間連続的に叩きます。 胚に直接蒸留水をかけて洗浄し、ティッシュペーパーを下からストレーナーに押し付けて水分を吸収させます。この手順を3回繰り返します。 脱毛胚のアライメント実体顕微鏡下で、鉗子を使用して胚を移植します。脱毛した胚を、PGC採取スライドガラス上で2列に並べます(図2A)。胚は、前側を右(操作する側)に向け、腹側を上にして配向します。注:このステップは20分で完了する必要があり、その間に通常約40個の胚を整列させます。 PGCコレクションスライドガラス上の胚の周りに胚プールフレームを取り付けます。1 μL の CPA 溶液(20% エチレングリコールと 1 M スクロースを含む 1x Ephrussi-Beadle Ringer 溶液、EBR、1x EBR:130 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl2、10 mM Hepes、pH 6.9)をフレームで囲まれた領域の 2 つの別々のスポットに滴下し、胚が乾燥しないようにプールにシリコンオイルを充填します(図 2A)。注:CPA溶液を調製するには、10.26gのスクロースを、3mLの10 x EBR溶液を含む約20 mLの蒸留H2Oに完全に溶解します。6mLのエチレングリコールを加え、次いで蒸留H2Oを最大30mLまで加える。完全に混合した後、0.22 mmのディスポーザブルメンブレンで溶液をろ過します。 PGC の収集ステップ2.3.2のPGCコレクションスライドガラスを、マイクロマニピュレーターシステムを備えた顕微鏡のステージに置きます。針をキャピラリーホルダーに取り付け、左列の最初の胚と針先を同じ焦点面に持ってきます。シリコーンオイルを針に2〜3秒間入れます。 左列の胚からPGCの採取を開始します。20倍の対物レンズを使用して、針を動かすのではなく顕微鏡ステージを動かすことによって、針先を胚の前端の表面にそっと動かし、胚を後端に向かって貫通させます。 針先が後端に達したら、針を少し引っ込め、針の中の卵黄を体細胞層のすぐ内側に完全に排出します。 針の圧力を一定に保ちながら、針先を後極のすぐ内側のPGCに移動し、ゆっくりと、しかし時間をかけずにPGCをロードします。 針を胚からすばやく引き出し、針から卵黄やその他の汚染物質を針からシリコーンオイルプールに排出し、PGCを針に保持します。次に、プールからきれいなシリコーンオイルをロードします。 左の行の他の胚について、手順2.4.2から2.4.5を繰り返します。新しい胚からPGCを採取する前に、ステップ2.4.5でロードしたシリコーンオイルをできるだけ多くのシリコーンオイルを体細胞層内に堆積させ、ロードしたPGCを針に保持します。これにより、新しくロードされた PGC が、以前に収集された PGC に隣接し、それらの間に材料が介在することがありません。 左列の胚からのPGC採取が完了したら、卵黄やその他の汚染物質からPGCを可能な限り分離します。これを達成するには、針のすべてのPGCを胚の表面に堆積させ、卵黄やその他の汚染物質を隣接する別の胚に取り除きます。 次に、右列の胚からPGCを収集します。右と左の行から収集した PGC を結合します。 PGCへの凍結保護剤(CPA)の塗布CPAで針を1滴洗った後、別の滴で新しいCPAを針にロードし、胚に沈着したPGCにCPAを追加します。CPAのボリュームはPGCのボリュームと同等である必要があります。 CPA の追加後、PGC 1 から 2 のクラスタからできるだけ多くの CPA を削除します。PGCはわずかに収縮し、CPA添加直後に正方形になります。 ニードルを空にしてから、シリコーンオイルを5秒以上ロードします。回収したすべてのPGCをロードしてから、シリコンオイルをもう一度5秒以上ロードします。PGCは、2層のシリコーンオイルで挟まれています(図2B)。注意: 卵黄、CPA、およびその他の汚染物質をできるだけ多く取り除くことが重要です。 PGCの凍結保存三方活栓(図1C)を開き、針をマイクロマニピュレーターから取り外します。針の表面についた油分をソフトティッシュペーパーで拭き取ります。針の先端にティッシュを直接触れないでください。 針をニードルホルダーに取り付け、ビニールテープを使用して根元の所定の位置にロックします(図1H)。ホルダーチューブにラベルを貼付します。 ホルダーを液体窒素に浸して、針を下に向けて瞬間凍結します。液体がラックから泡立つのを止めるまで、ホルダーを離さないでください。 ホルダーは、気相領域ではなく、液相領域の液体窒素貯蔵タンクに保管してください。 3. PGCの融解と移植 無ガメティック宿主ハエからの胚の収集、脱摩擦、および整列ステップ2に従って、無ガメティック宿主ハエから胚を収集して脱chorionateします。 ステージ5の無配球性宿主胚を移植スライドガラスに合わせます。ただし、今回は後部を右(操作する側)に向け、腹側を上部に向けます(図5)。約30個の胚を2列に並べて20分で行います。 胚を整列させながら、部屋の湿度で必要な場合は加湿器を2〜10分間操作します(表1)。理想的な湿度は30%から40%ですが、これは温度条件によって異なる場合があります。 宿主胚におけるPGCの融解と移植凍結保存されたPGCを迅速に融解するには、ニードルを含むホルダーを、ニードルを下に向けて室温の1x EBR溶液に滑り込ませ、10秒間浸しておきます。 移植用スライドガラスを顕微鏡のステージに置きます。凍結融解した針をキャピラリーホルダーに取り付け、左列の最初の胚と針先を同じ焦点面に持ってきます。 20倍の対物レンズを使用して、針先を胚の後端の表面にそっと動かします。 各胚の外側をそっと突いて、ゆっくりと元の形に戻ることを確認します。突っ込むことで、胚の内圧が高すぎたり低すぎたりしないことを確認します。 針を静かに動かし、後極から胚を貫通させます。 胚の硝子膜と体細胞層の間に、正確に後極のすぐ内側に約10〜20個のPGCを静かに堆積させます。体細胞層に沈着させないでください。ペリビテリン液が胚から漏れた場合は、漏れた液体を針に吸い込んで取り除きます。 針を胚から引っ込めます。後続の胚について、手順3.2.5と3.2.6を繰り返します。 4. 胚のインキュベートとドナー株の回復 移植されたPGCを受けない胚をすべて除去し、残りの胚を加湿チャンバー(図1G)で25°Cでインキュベートします。 移植後24時間以上経過し、孵化後できるだけ早く、鉗子を使用して孵化した幼虫を拾い上げ、標準的な ショウジョウバエ の餌バイアルに移し、25°Cでインキュベートします。 株を復活させるには、新たに出現した雌雄を交配します(図6)。注:無閤性宿主は、バランサー染色体株に交配することなく、ゲノム全体を一度に復元することを可能にします。バイアル内での無ガメティックオスの共存は、メスが交配したとしても、再交配に対する受容性の低下を含む長期的な交配後の反応を示さないため、問題にはなりません18,19。