Криоконсервация первичных зародышевых клеток и возрождение штаммов дрозофилы

1. Подготовка оборудования Система микроманипулятора: Соберите систему микроманипулятора для сбора и пересадки клеток (Рисунок 1A). Предметные стекла из коллекции PGC (рис. 2A)Для приготовления гептанового клея отрежьте двусторонний скотч длиной примерно 30 см и замочите его на ночь в 7 мл технического (обычного) раствора гептана. Нарисуйте две параллельные опорные линии для выравнивания эмбрионов на обратной стороне предметного стекла. Нанесите капли вышеуказанного гептанового клея на предметное стекло (со стороны без линий) с помощью пипетки Пастера. Высушите поверхность предметного стекла на воздухе, пока она не станет белой. Повторите добавление и распределение капель гептанового клея и снова высушите предметное стекло.ПРИМЕЧАНИЕ: Клей предотвращает растекание жидких растворов по плоской поверхности и облегчает загрузку водных растворов в иглу. Чтобы сделать каркасы для бассейна для эмбрионов, наклейте на разделочную доску три слоя стандартной виниловой ленты толщиной 0,2 мм, например, изоленты. Разрежьте ленту на прямоугольники шириной 1,5 см. Затем отрежьте все три слоя скотча, оставив рамку от 2 до 3 мм.ПРИМЕЧАНИЕ: Рамка для эмбриопула прикрепляется после выравнивания эмбрионов, чтобы сформировать пул для эмбрионов. Иглы для трансплантацииПРИМЕЧАНИЕ: Все коммерчески доступные иглы на момент проведения этого исследования были слишком узкими или слишком широкими для криоконсервации PGC.Сделайте иглу, используя стеклянный капилляр и съемник. Мы используем съемник NARISHIGE PN-31 с уровнем нагревателя 85,0-98,4, основным уровнем магнита 57,8 и подуровнем магнита 45,0. Чтобы изготовить иглу с приблизительной толщиной стенки 1 мкм и наконечником длиной около 200 мкм с внутренним диаметром 10-12 мкм, отполируйте кончик иглы в следующем трехступенчатом процессе (Рисунок 3). Сначала шлифуйте кончик иглы под углом 30° со скоростью 780 об/мин, пока наконечник не достигнет внутреннего диаметра 10-12 мкм. Этот первый этап шлифования занимает примерно 1 час.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы не сломать кончик иглы, сначала поверните точильный камень, а затем осторожно переместите иглу вниз на точильный камень. Нарисуйте линию на верхней части иглы, чтобы отследить нужный угол. Поверните иглу против часовой стрелки на 90° и снова отполируйте ее со скоростью 180 об/мин. Это займет примерно 5 минут. Поверните иглу по часовой стрелке на 45° и отполируйте ее со скоростью 180 об/мин в течение одной секунды. Поместите предметное стекло с каплей смеси хромовой кислоты (ОСТОРОЖНО: токсично) на предметный столик микроскопа. Приложите иглу к капилляродержателю (рис. 1D) под углом 10°-13° относительно поверхности предметного стекла, осторожно переместите иглу вниз и погрузите наконечник в смесь хромовой кислоты. Вытягивая и толкая поршень (рисунок 1Б), несколько раз механически загружайте и выгружайте раствор из иглы, чтобы удалить стеклянный мусор в игле. Обязательно очистите и внешнюю стенку. Промойте внутреннюю и внешнюю часть иглы два раза дистиллированной водой, чтобы полностью удалить хромовую кислоту. 2. Сбор и криоконсервация ПГК Сбор эмбрионовПересадите соответствующее количество мух интересующего донорского штамма (примерно 450 мух каждого пола для чашки для сбора эмбрионов) в чашку для сбора эмбрионов с планшетом для сбора эмбрионов (рис. 1E) и инкубируйте их при температуре 25 °C. Обычно мы используем 3-5-дневных мух-родителей, которых выращивают в менее скученных условиях при комнатной температуре (23-25 °C). Проведите два 30-минутных предварительных сбора и выбросьте все отложенные яйца. Поскольку самки могут сохранять оплодотворенные яйца, которые развиваются в яйцеводе, этот этап необходим для синхронизации яйцекладки на этапе 2.1.3 (рис. 4). После двух предварительных сборов собирайте эмбрионы в течение 50 минут, а затем инкубируйте собранные эмбрионы во влажной камере при температуре 25 °C, чтобы эмбрионы могли развиться до стадии бластодермы (ранняя стадия 517). Время инкубации обычно составляет 100 мин, но может быть увеличено до 120 мин, в зависимости от штамма (рис. 4).ПРИМЕЧАНИЕ: Увлажненная камера создается путем размещения влажного бумажного полотенца на дне пластиковой коробки и опрыскивания его водяным туманом перед использованием. У эмбрионов на ранней стадии 5 формирование ПГК завершено, но соматическая клеточная нет. Точная стадия эмбриона определяется под сложным микроскопом на шаге 2.4. Дехорионирующие эмбрионыНанесите каплю дистиллированной воды на сетчатый фильтр из нержавеющей стали (150 меш, отверстие 109 мкм, диаметр проволоки 60 мкм; Рисунок 1F). С помощью щипцов возьмите эмбрионы из пластины для сбора эмбрионов и поместите их в каплю воды. Прижмите папиросную бумагу к ситечку снизу, чтобы впитать воду. Добавьте капли свежего 5% (в виде Cl) раствора гипохлорита натрия к эмбрионам и непрерывно постукивайте по ситечку в течение 10 с. Промойте эмбрионы, обрызгав их дистиллированной водой, и прижмите папиросную бумагу к ситечку снизу, чтобы впитать воду. Повторите этот шаг 3 раза. Выравнивание дехорионированных эмбрионовПод стереомикроскопом используйте щипцы для переноса эмбрионов. Выровняйте дехорионированные эмбрионы в два ряда на предметном стекле для сбора PGC вдоль двух контрольных линий (рис. 2A). Эмбрионы ориентированы передней стороной вправо (сторона, с которой будут манипулировать) и вентральной стороной вверх.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап должен быть завершен через 20 минут, в течение которых мы обычно выравниваем около 40 эмбрионов. Прикрепите рамку для бассейна эмбрионов вокруг эмбрионов на предметное стекло из коллекции PGC. Капните 1 мкл раствора CPA (1x раствор Ephrussi-Beadle Ringer, EBR, содержащий 20% этиленгликоля и 1 М сахарозы; 1x EBR: 130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2 и 10 мМ Hepes при pH 6,9) в двух отдельных точках в области, огороженной рамой, и наполните бассейн силиконовым маслом, чтобы предотвратить высыхание эмбрионов (Рисунок 2A).ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления раствора CPA полностью растворите 10,26 г сахарозы примерно в 20 мл дистиллированногоH2O, содержащего 3 мл 10 x EBR раствора. Добавьте 6 мл этиленгликоля, а затем добавьте дистиллированныйH2Oдо 30 мл. После тщательного перемешивания процеживают раствор через одноразовую мембрану 0,22 мм. Сбор PGCПоместите предметное стекло PGC-коллекции шага 2.3.2 на предметный столик микроскопа, оснащенного системой микроманипулятора. Приложите иглу к капилляродержателю и поместите первый эмбрион в левом ряду и кончик иглы в одну фокальную плоскость. Загрузите силиконовое масло в иглу на 2-3 с. Начните сбор ПГК с эмбрионов в левом ряду. Используя объектив с 20-кратным увеличением, осторожно переместите кончик иглы к поверхности переднего конца эмбриона и проникните в эмбрион к заднему концу, не перемещая иглу, а перемещая столик микроскопа. Когда кончик иглы достигнет заднего конца, слегка втяните иглу и полностью выпустите желток в игле прямо внутри слоя соматической клетки. Поддерживая постоянное давление в игле, переместите кончик иглы к ПГК внутри заднего полюса и осторожно, но не занимая много времени, загрузите ПГК. Быстро вытащите иглу из эмбриона и выпустите желток и другие загрязнения из иглы в бассейн с силиконовым маслом, удерживая PGC в игле. Затем загрузите чистое силиконовое масло из бассейна. Повторите шаги 2.4.2 – 2.4.5 для других эмбрионов в левом ряду. Перед сбором PGC из нового эмбриона поместите как можно больше силиконового масла, загруженного на этапе 2.4.5, внутрь слоя соматической клетки, сохраняя загруженные PGC в игле. Это гарантирует, что вновь загруженные PGC будут соседствовать с ранее собранными PGC без какого-либо промежуточного материала между ними. После завершения сбора ПГК от эмбрионов в левом ряду максимально отделите ПГК от желтка и других загрязняющих веществ. Для этого поместите все PGC в игле на поверхность эмбриона и удалите желток или другие загрязнения другому соседнему эмбриону. Затем соберите PGC с эмбрионов в правом ряду. Объедините PGC, собранные из правого и левого рядов. Нанесение криопротектора (КПА) на ПГКПосле промывки иглы с КПА в одной капле, загрузите свежий ЦПА в другой капле в иглу и добавьте ЦПА к ПГК, отложенным на эмбрионе. Объем CPA должен быть эквивалентен объему PGC. Удалите как можно больше CPA из кластера PGC через 1-2 с после добавления CPA. PGC немного сжимаются и приобретают квадратную форму сразу после добавления CPA. Опорожните иглу, а затем залейте силиконовое масло на 5 секунд или дольше. Загрузите все собранные PGC, а затем снова залейте силиконовое масло в течение 5 с или дольше. Теперь PGC зажаты между двумя слоями силиконового масла (рис. 2B).ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить как можно больше желтка, CPA и других загрязнений. Криоконсервирующие ПГКОткройте трехходовой запорный кран (рис. 1C), а затем отсоедините иглу от микроманипулятора. Промокните масло с поверхности иглы мягкой папиросной бумагой. Не прикасайтесь салфеткой непосредственно к кончику иглы. Прикрепите иглу к иглодержателю и зафиксируйте ее в нужном положении у основания с помощью виниловой ленты (Рисунок 1H). Прикрепите этикетку к трубке держателя. Мгновенно заморозьте держатель иглой, направленной вниз, погрузив его в жидкий азот. Не отпускайте держатель до тех пор, пока жидкость не перестанет шипеть из стойки. Храните держатель в резервуаре для хранения жидкого азота в зоне жидкой фазы, а не в зоне паровой фазы. 3. Размораживание и пересадка ПГК Сбор, дехорионирование и выравнивание эмбрионов агатетических мух-хозяевСоберите и дехорионатируйте эмбрионы у мух-агаметных хозяев, выполнив шаг 2. Выровняйте агаметные эмбрионы хозяина 5-й стадии на предметном стекле для трансплантации. Однако на этот раз ориентируйте заднюю часть вправо (сторону, которой нужно манипулировать) и вентральную вверху (рис. 5). Выровняйте примерно 30 эмбрионов в два ряда за 20 минут. Во время выравнивания эмбрионов включите увлажнитель воздуха в течение 2-10 минут, если этого требует влажность в помещении (Таблица 1). Идеальная влажность составляет от 30% до 40%, но она может варьироваться в зависимости от тепловых условий. Размораживание и трансплантация ПЗК в эмбрионы хозяинаЧтобы быстро разморозить криоконсервированные PGC, поместите держатель с иглой в раствор 1x EBR комнатной температуры иглой вниз и держите его погруженным в воду в течение 10 с. Поместите предметное стекло для трансплантации на предметный столик микроскопа. Прикрепите замораживающе-размороженную иглу к капилляродержателю и поместите первый эмбрион в левом ряду и кончик иглы в одну фокальную плоскость. Используя объектив с 20-кратным увеличением, осторожно переместите кончик иглы к поверхности заднего конца эмбриона. Осторожно протолкните каждый эмбрион снаружи и убедитесь, что они медленно возвращаются к своей первоначальной форме. Прощупывание подтвердит, что внутреннее давление эмбриона не слишком высокое или слишком низкое. Осторожно перемещают иглу и проникают в эмбрион от заднего полюса. Аккуратно поместите примерно 10-20 PGC непосредственно внутри заднего полюса, точно между вителлиновой мембраной и слоем соматических клеток эмбриона. Избегайте их депонирования в слое соматических клеток. Если перивителлиновая жидкость вытекает из эмбриона, засосите вытекшую жидкость в иглу и удалите ее. Втяните иглу из эмбриона. Повторите шаги 3.2.5 и 3.2.6 для последующих эмбрионов. 4. Инкубация эмбрионов и восстановление донорских штаммов Удалите все эмбрионы, которые не получили трансплантированные PGC, и инкубируйте оставшиеся эмбрионы в увлажненной камере (рис. 1G) при температуре 25 °C. Через 24 ч или более после трансплантации и как можно скорее после вылупления используют щипцы для захвата и переноса вылупившихся личинок в стандартные пищевые флаконы дрозофилы и инкубируют при 25 °C. Чтобы возродить штамм, скрещивайте недавно появившихся самок и самцов (рис. 6).ПРИМЕЧАНИЕ: Агаметические хозяева позволяют восстанавливать сразу весь геном без скрещивания с балансирно-хромосомными штаммами. Сосуществование агаметных самцов в пробирке не будет иметь значения, потому что самки, даже если они спариваются с ними, не демонстрируют долгосрочных реакций после спаривания, включая снижение восприимчивости к повторному спариванию18,19.