JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים והחייאת זני דרוזופילה

Published: December 01, 2023
doi:
10.3791/65985
, , , , , ,
1KYOTO Drosophila Stock Center,Kyoto Institute of Technology, 2Life Science Center for Survival Dynamics, Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA),University of Tsukuba, 3Research Center of Genetic Resources,National Agriculture and Food Research Organization, 4Shizuoka Prefectural Ogasa High School

Summary

שיטת שימור ארוכת טווח לזני דרוזופילה כחלופה להעברה תכופה של זבובים בוגרים לבקבוקוני מזון טריים רצויה מאוד. פרוטוקול זה מתאר שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים של דרוזופילה והחייאת זנים באמצעות השתלתם בעוברים מארחים אגמטיים.

Abstract

זני דרוזופילה חייבים להישמר על ידי העברה תכופה של זבובים בוגרים לבקבוקונים חדשים. זה טומן בחובו סכנה של הידרדרות מוטציות ושינויים פנוטיפיים. לכן פיתוח שיטה חלופית לשימור ארוך טווח ללא שינויים כאלה הוא הכרחי. למרות ניסיונות מוצלחים קודמים, שימור בהקפאה של עוברי דרוזופילה עדיין אינו שימושי מבחינה מעשית בגלל יכולת שחזור נמוכה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לשימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים (PGC) ולהחייאת זנים באמצעות השתלת PGCs משומרים בהקפאה בעוברים מארחים אגמטיים מסוג Drosophila melanogaster (D. melanogaster). PGCs חדירים מאוד לחומרים מגנים על הקפאה (CPAs), ושונות התפתחותית ומורפולוגית בין זנים היא פחות בעייתית מאשר בשימור בהקפאה של עוברים. בשיטה זו, PGCs נאספים מכ -30 עוברים תורמים, מועמסים לתוך מחט לאחר טיפול CPA, ולאחר מכן נשמרים בהקפאה בחנקן נוזלי. כדי לייצר גמטות שמקורן בתורם, ה-PGCs השמורים בהקפאה במחט מופשרים ולאחר מכן מופקדים בכ-15 עוברים מארחים אגמטיים. בפרוטוקול זה הושגה תדירות של לפחות 15% זבובים פוריים, ומספר הצאצאים לכל זוג פורה היה תמיד די והותר כדי להחיות את הזן המקורי (מספר הצאצאים הממוצע היה 77.2 ± 7.1), מה שמצביע על יכולתם של PGCs שמורים בהקפאה להפוך לתאי גזע של תאי גזע. המספר הממוצע של זבובים פוריים למחט היה 1.1 ±-0.2, ו-9 מתוך 26 מחטים הניבו שני צאצאים פוריים או יותר. נמצא כי 11 מחטים מספיקות כדי לייצר 6 צאצאים או יותר, שבהם נכללים ככל הנראה לפחות נקבה אחת וזכר אחד. הפונדקאי האגמטי מאפשר להחיות את הזן במהירות פשוט על ידי חציית זבובים נקביים וזכרים שזה עתה הופיעו. בנוסף, ל-PGCs יש פוטנציאל לשמש ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום.

Introduction

תחזוקת זני דרוזופילה על ידי העברת זבובים בוגרים לבקבוקוני מזון חדשים גורמת בהכרח להצטברות מוטציות ושינויים אפיגנטיים לאורך זמן. פיתוח שיטה חלופית לתחזוקה ארוכת טווח של זני דרוזופילה ללא שינויים כאלה הוא הכרחי, במיוחד עבור זני ייחוס שבהם יש לשמור על כל הגנום. מספר ניסיונות מוצלחים לשמר בהקפאה עוברים או שחלות דרוזופילה תוארו 1,2,3. למרבה הצער, הם עדיין לא בשימוש מעשי בגלל יכולת שחזור נמוכה. ואכן, לעוברים בשלב מוקדם יש שיעור הישרדות נמוך לאחר שימור בהקפאה בגלל תכולת החלמון הגבוהה שלהם, המעכבת חדירה ודיפוזיה של חומר מגן קריוגני (CPA) 2,3. חדירות CPA מוגבלת מאוד גם על ידי שכבות השעווה של עוברים בשלב מאוחר. קשה וגוזל זמן למצוא פרק זמן ספציפי שבו לעוברים יש שיעור הישרדות גבוה ושכבת שעווה דקה יותר. לאחרונה, Zhan et al.4 שיפרו שיטות לחדירת עוברים, העמסת CPA וויטריפיקציה והצליחו להקפיא עוברים מזנים מרובים. עם זאת, השיטות אינן קלות ליישום מכיוון שהכדאיות של עוברים לאחר חדירה נוטה להיות גרועה. לכן, שיפור נוסף ופיתוח של גישות חלופיות עדיין נדרשים. שיטות הכוללות שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים (PGC) הן גישה חלופית לתחזוקה ארוכת טווח של זני דרוזופילה.

השתלת PGC (המכונה גם תאי קוטב) שימשה ליצירת כימרות נבט, במיוחד נקבות, כדי לחקור תהליכים כגון השפעות אימהיות של מוטציות קטלניות זיגוטיות וקביעת מין של תאי נבט 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGCs הם הרבה יותר קטנים מאשר עוברים והם צפויים להיות חדירים מאוד עבור רוב cryoprotectants. יתר על כן, השונות ההתפתחותית והמורפולוגית בין הזנים בעייתית פחות, ופונדקאי אגמטי מאפשר שחזור מהיר של גנומים שלמים. לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה לשימור קריוגניPGC 13, המונעת את השינויים הגנטיים והאפיגנטיים הבלתי נמנעים בזני דרוזופילה. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול המפורט.

שיטת שימור קריוגנית זו דורשת מומחיות ספציפית בטיפול ובמכשור PGC. בעוד שגישה שלב אחר שלב עשויה להיות פתרון יעיל עבור אלה שאינם מכירים אותה, היא עשויה להיות לא מתאימה למעבדות קטנות בשל דרישות המכשור. פרוטוקול PGC זה לשימור קריוגני יכול להיות מותאם בקלות רבה יותר לשימוש עם מיני דרוזופילה שונים ומיני חרקים שונים מאשר פרוטוקולי שימור הקפאה של עוברים בגלל הבדלים התפתחותיים ומורפולוגיים קטנים יותר. PGCs יכולים לשמש גם ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום 14,15,16. לסיכום, ניתן להשתמש בשיטה זו במרכזי מלאי ובמעבדות אחרות כדי לשמור על זני זבובים וזני חרקים אחרים לפרקי זמן ממושכים ללא שינויים.

Protocol

1. הכנת ציוד מערכת מיקרומניפולטור: הרכיבו מערכת מיקרומניפולטור כדי לאסוף ולהשתיל תאים (איור 1A). שקופיות זכוכית מאוסף PGC (איור 2A)להכנת דבק הפטן, חותכים סרט דו-צדדי באורך של כ-30 ס”מ ומשרים אותו למשך הלילה בתמיסת הפטן טכנית (רגילה) באורך של 7 מ”ל. ציירו שני קווי ייחוס מקבילים ליישור העובר בגב שקופית זכוכית. מורחים טיפות של דבק הפטן הנ”ל על מגלשת הזכוכית (בצד ללא הקווים) באמצעות פיפטה פסטר. יבשו באוויר את פני השטח של המגלשה עד שהיא הופכת ללבנה. חזרו על הוספה ופיזור של טיפות דבק הפטאן וייבשו שוב את המגלשה.הערה: הדבק מונע מתמיסות נוזליות להתפשט על פני השטח השטוח ומקל על העמסת תמיסות מימיות לתוך מחט. כדי ליצור מסגרות של בריכת עוברים, הדביקו שלוש שכבות של סרט ויניל סטנדרטי בעובי 0.2 מ”מ, כגון סרט חשמלי, על קרש חיתוך. חותכים את הסרט למלבנים ברוחב 1.5 ס”מ. לאחר מכן, לחתוך את כל שלוש שכבות של קלטת, משאיר מסגרת 2 עד 3 מ”מ.הערה: מסגרת מאגר עוברים מודבקת לאחר יישור עוברים, כדי ליצור מאגר לעוברים. מחטי השתלההערה: כל המחטים שהיו זמינות מסחרית בזמן מחקר זה היו צרות מדי או רחבות מדי לשימור בהקפאה של PGC.צור מחט באמצעות נימי זכוכית ומושך. אנו משתמשים במושך NARISHIGE PN-31 כאשר רמת המחמם היא 85.0-98.4, המפלס הראשי של המגנט הוא 57.8 ותת-רמת המגנט היא 45.0. כדי ליצור מחט בעובי דופן משוער של 1 מיקרומטר וקצה באורך של כ-200 מיקרומטר בקוטר פנימי של 10-12 מיקרומטר, לטש את קצה המחט בתהליך שלושת השלבים הבא (איור 3). ראשית, טחנו את קצה המחט בזווית של 30° במהירות של 780 סל”ד עד שהקצה יקבל קוטר פנימי של 10-12 מיקרומטר. שלב השחזה הראשון אורך כשעה.הערה: כדי למנוע שבירת קצה המחט, סובב תחילה את אבן השחזה ולאחר מכן העבר בעדינות את המחט כלפי מטה אל אבן השחזה. צייר קו על החלק העליון של המחט כדי לעקוב אחר הזווית הרצויה. סובב את המחט נגד כיוון השעון ב-90° ולטש אותה שוב במהירות של 180 סל”ד. זה לוקח בערך 5 דקות. סובב את המחט בכיוון השעון 45° ולטש אותה במהירות של 180 סל”ד למשך שנייה אחת. הניחו מגלשת זכוכית עם טיפה של תערובת חומצה כרומית (זהירות: רעילה) על במת המיקרוסקופ. חברו את המחט למחזיק הנימים (איור 1D) בזווית של 10°-13° ביחס למשטח ההחלקה, הזיזו בזהירות את המחט כלפי מטה וטבלו את הקצה בתערובת החומצה הכרומית. על-ידי משיכה ודחיפה של הבוכנה (איור 1B), העמסה מכנית ופריקה של התמיסה מהמחט מספר פעמים כדי להסיר פסולת זכוכית במחט. הקפידו לנקות גם את הקיר החיצוני. שטפו את החלק הפנימי והחיצוני של המחט פעמיים במים מזוקקים כדי להסיר את החומצה הכרומית לחלוטין. 2. איסוף ושימור בהקפאה של PGCs איסוף עובריםהעבירו מספר מתאים של זבובים מהזן התורם המעניין (כ-450 עבור כל מין עבור איסוף העוברים) לתוך איסוף עוברים עם צלחת איסוף עוברים (איור 1E) ודגרו עליהם בטמפרטורה של 25°C. בדרך כלל אנו משתמשים בזבובי הורים בני 3 עד 5 ימים המגודלים בתנאים פחות צפופים בטמפרטורת החדר (23-25 מעלות צלזיוס). בצעו שני אוספים מקדימים של 30 דקות והשליכו את כל הביצים שהוטלו. מאחר שהנקבות יכולות לשמור ביציות מופרות שמתפתחות באובידוקט, השלב הזה נדרש כדי לסנכרן את הטלת הביצים בשלב 2.1.3 (איור 4). לאחר שני האוספים המוקדמים, אספו את העוברים במשך 50 דקות ולאחר מכן דגרו על העוברים שנאספו בתא לח ב 25 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לעוברים להתפתח לשלב הבלסטודרם (שלב מוקדם 517). זמן הדגירה הוא בדרך כלל 100 דקות, אולם ניתן להאריך אותו עד 120 דקות, בהתאם למאמץ (איור 4).הערה: תא לחות מיוצר על ידי הנחת מגבת נייר לחה בתחתית קופסת פלסטיק וריסוס שלה בתרסיס מים לפני השימוש. בעוברים בשלב מוקדם 5, היווצרות PGC הושלמה, אך צלולריזציה סומטית לא. השלב המדויק של עובר נקבע תחת מיקרוסקופ מורכב בשלב 2.4. עוברים dechorionatingהפקדת טיפת מים מזוקקים על מסננת רשת נירוסטה (150 רשת, פתח 109 מיקרומטר, קוטר חוט 60 מיקרומטר; איור 1F). בעזרת מלקחיים, אספו עוברים מצלחת איסוף העוברים והכניסו אותם לטיפת המים. לחץ על נייר הטישו כנגד המסננת מלמטה כדי לספוג את המים. הוסף טיפות של תמיסת נתרן היפוכלוריט טרייה 5% (בצורת Cl) לעוברים והקש ברציפות על המסננת במשך 10 שניות. שטפו את העוברים על ידי התזת מים מזוקקים ישירות ולחצו נייר טישו על המסננת מלמטה כדי לספוג את המים. חזור על שלב זה 3x. יישור עוברים דכוריונייםתחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש במלקחיים כדי להחזיר עוברים. יישרו את העוברים המכוריוניים בשתי שורות על שקופית זכוכית לאיסוף PGC לאורך שני קווי הייחוס (איור 2A). העוברים מכוונים עם הקדמי שלהם ימינה (הצד שיש לתפעל אותו) והצד הגחוני כלפי מעלה.הערה: שלב זה צריך להסתיים תוך 20 דקות, שבמהלכן אנו בדרך כלל מיישרים כ -40 עוברים. הדביקו מסגרת מאגר עוברים סביב העוברים במגלשת הזכוכית של אוסף PGC. טיפה 1 μL של תמיסת CPA (תמיסת Ephrussi-Beadle Ringer אחת, EBR, המכילה 20% אתילן גליקול ו-1 M סוכרוז; 1x EBR: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 ו-10 mM Hepes ב-pH 6.9) בשתי נקודות נפרדות באזור המוקף במסגרת ומלאו את הבריכה בשמן סיליקון כדי למנוע מהעוברים להתייבש (איור 2A).הערה: להכנת תמיסת CPA, יש להמיס לחלוטין 10.26 גרם סוכרוז בכ-20 מ”ל של H2O מזוקק המכיל 3 מ”ל של תמיסת EBR 10 x. הוסף 6 מ”ל אתילן גליקול ולאחר מכן הוסף H2O מזוקק עד 30 מ”ל. לאחר ערבוב יסודי, מסננים את התמיסה דרך קרום חד פעמי בקוטר 0.22 מ”מ. איסוף PGCsהניחו את שקופית הזכוכית של אוסף PGC של שלב 2.3.2 על במה של מיקרוסקופ מצויד במערכת מיקרומניפולטור. חברו את המחט למחזיק הנימים והביאו את העובר הראשון בשורה השמאלית ואת קצה המחט לאותו מישור מוקד. מעמיסים שמן סיליקון לתוך המחט למשך 2-3 שניות. התחל איסוף PGC מעוברים בשורה השמאלית. באמצעות עדשה אובייקטיבית פי 20, הזיזו בעדינות את קצה המחט אל פני השטח של הקצה הקדמי של העובר וחדרו את העובר לכיוון הקצה האחורי, לא על ידי הזזת המחט אלא על ידי הזזת שלב המיקרוסקופ. כאשר קצה המחט מגיע לקצה האחורי, משכו מעט את המחט ופרקו לחלוטין כל חלמון במחט ממש בתוך שכבת התא הסומטי. תוך שמירה על לחץ קבוע במחט, הזיזו את קצה המחט אל ה-PGCs ממש בתוך הקוטב האחורי ובעדינות, אך מבלי לקחת זמן רב, העמיסו את ה-PGCs. משוך את המחט מהעובר במהירות ושחרר חלמון ומזהמים אחרים מהמחט לתוך בריכת שמן הסיליקון, תוך שמירה על PGCs במחט. לאחר מכן, העמיסו שמן סיליקון נקי מהבריכה. חזור על שלבים 2.4.2 עד 2.4.5 עבור העוברים האחרים בשורה השמאלית. לפני איסוף PGCs מעובר חדש, הפקידו כמה שיותר משמן הסיליקון הטעון בשלב 2.4.5 בתוך שכבת התא הסומטי תוך שמירה על PGC טעון במחט. הדבר מבטיח כי PGCs שנטענו לאחרונה צמודים ל-PGCs שנאספו בעבר ללא כל חומר מתערב ביניהם. לאחר השלמת איסוף PGC מעוברים בשורה השמאלית, יש להפריד את PGC מהחלמון וממזהמים אחרים ככל האפשר. כדי להשיג זאת, הפקידו את כל PGCs במחט על פני השטח של עובר והסירו חלמון או מזהמים אחרים לעובר שכן אחר. לאחר מכן, אספו PGCs מעוברים בשורה הימנית. שלב את ה-PGCs שנאספו מהשורה הימנית והשמאלית. מריחת חומר הגנה קריוגני (CPA) על PGCsלאחר שטיפת המחט עם CPA בטיפה אחת, יש להעמיס CPA טרי בטיפה נוספת לתוך המחט ולהוסיף CPA ל-PGCs שהופקדו על העובר. נפח ה-CPA צריך להיות שווה לזה של ה-PGCs. הסר כמה שיותר CPA מאשכול PGCs 1-2 שניות לאחר הוספת CPA. PGCs מתכווצים מעט והופכים מרובעים בצורתם מיד לאחר הוספת רו”ח. רוקנו את המחט ולאחר מכן טענו שמן סיליקון למשך 5 שניות או יותר. טען את כל PGC שנאסף ולאחר מכן טען שמן סיליקון שוב במשך 5 שניות או יותר. PGCs דחוקים כעת בין שתי שכבות של שמן סיליקון (איור 2B).הערה: חשוב להסיר כמה שיותר חלמון, רו”ח ומזהמים אחרים. Cryopreserving PGCsפתחו את הסטופקוק התלת-כיווני (איור 1C) ואז נתקו את המחט מהמיקרומניפולטור. כתם את השמן מעל פני המחט עם נייר טישו רך. אין לגעת ישירות בקצה המחט עם הרקמה. חברו את המחט למחזיק מחט ונעלו אותה במקומה בבסיס באמצעות סרט ויניל (איור 1H). הצמידו תווית לצינור המחזיק. הבזק להקפיא את המחזיק עם המחט מצביע כלפי מטה על ידי טבילתו בחנקן נוזלי. אין לשחרר את המחזיק עד שהנוזל מפסיק לזלוג מהמדף. יש לאחסן את המחזיק במיכל אחסון חנקן נוזלי באזור הפאזה הנוזלית, ולא באזור שלב האדים. 3. הפשרה והשתלה של PGCs איסוף, דה-כוריון ויישור עוברים מזבובי פונדקאי אגמטייםאספו ונטרלו עוברים מזבובי פונדקאי אגמטיים לאחר שלב 2. יישרו את העוברים המארחים האגמטיים שלב 5 על שקופית זכוכית להשתלה. אולם הפעם, כוונו את החלק האחורי ימינה (הצד שיש לתפעל אותו) ואת הגחון למעלה (איור 5). סדרו כ-30 עוברים בשתי שורות ב-20 דקות. בעת יישור העוברים, הפעילו מכשיר אדים למשך 2-10 דקות אם לחות החדר דורשת זאת (טבלה 1). הלחות האידיאלית היא 30% עד 40%, אך זה יכול להשתנות בהתאם לתנאים התרמיים. הפשרה והשתלה של PGCs בעוברים מארחיםכדי להפשיר במהירות PGCs שמורים בהקפאה, יש להחליק את המחזיק המכיל את המחט לתמיסת EBR 1x בטמפרטורת החדר כאשר המחט מצביעה כלפי מטה ולהשאיר אותה שקועה למשך 10 שניות. הניחו את שקופית זכוכית ההשתלה על במת מיקרוסקופ. חברו את המחט המופשרת בהקפאה למחזיק הנימים והביאו את העובר הראשון בשורה השמאלית ואת קצה המחט לאותו מישור מוקד. בעזרת עדשה אובייקטיבית פי 20, הזיזו בעדינות את קצה המחט אל פני השטח של הקצה האחורי של העובר. דחפו בעדינות את החלק החיצוני של כל עובר וודאו שהוא חוזר לאט לאט לצורתו המקורית. הדרבון יאשר כי הלחץ הפנימי של העובר אינו גבוה מדי או נמוך מדי. הזיזו בעדינות את המחט וחדרו לעובר מהקוטב האחורי. מפקידים בעדינות כ-10-20 PGCs ממש בתוך הקוטב האחורי, בדיוק בין קרום ויטלין לבין שכבת התא הסומטית של העובר. הימנע הפקדתם בשכבת התא הסומטי. אם נוזל הפריביטלין דולף מהעובר, יש למצוץ את הנוזל שדלף לתוך המחט ולהסיר אותו. משכו את המחט מהעובר. חזור על שלבים 3.2.5 ו- 3.2.6 עבור עוברים עוקבים. 4. דגירה על עוברים ושיקום זני תורם הוציאו עוברים שלא קיבלו PGC מושתל ודגרו על העוברים הנותרים בתא לח (איור 1G) בטמפרטורה של 25°C. לאחר 24 שעות או יותר לאחר ההשתלה ובהקדם האפשרי לאחר הבקיעה, השתמשו במלקחיים כדי להרים ולהעביר זחלים שבקעו לבקבוקוני מזון דרוזופילה סטנדרטיים ולדגור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. כדי להחיות את הזן, הצליבו נקבות וזכרים שזה עתה הופיעו (איור 6).הערה: מארחים אגמטיים מאפשרים לשחזר את כל הגנום בבת אחת מבלי לעבור לזני כרומוזום מאזנים. הדו-קיום של זכרים אגמטיים בבקבוקון לא ישנה מכיוון שהנקבות, גם אם הן מזדווגות איתם, אינן מראות תגובות ארוכות טווח לאחר ההזדווגות, כולל ירידה בפתיחות לחזרה18,19.

Representative Results

היעילות של השתלת PGC בהקפאה דווחה על ידי Asaoka et al.13 והיא ניתנת בטבלה 2 להשתלת PGCs בהקפאה למשך יום אחד או יותר בחנקן נוזלי. שיעור הבקיעה היה 168/208 עוברים מושתלים (80.8%), ושיעור הבקיעה מהעובר לבוגר היה 87/208 (41.8%). שכיחות הזבובים הפוריים הייתה 28/87 (32.2%). תדירות זו לא הייתה שונה בין PGCs שמורים בהקפאה במשך 8 עד 30 יום לבין אלה שנשמרים בהקפאה במשך 31-150 ימים (20/57 לעומת 8/30, G’ = 0.63, p >0.1, d.f. = 1). המספר הממוצע של צאצאים לזוג היה 77.2 ± 7.1 (n = 18, 28-122), מה שמצביע על היכולת של PGCs שמורים בהקפאה להפוך לתאי גזע של תאי גזע נבט. מתוך 26 המחטים, 10 לא הפיקו צאצאים פוריים, 7 מחטים ייצרו צאצא פורה אחד, 7 מחטים ייצרו 2 צאצאים פוריים ו-2 מחטים ייצרו 3 או 4 צאצאים פוריים. המספר הממוצע של זבובים פוריים למחט היה 1.1 ± 0.2. בהתבסס על נתונים אלה, בביטחון של 95%, 11 מחטים מספיקות כדי לייצר 6 צאצאים או יותר, שבהם לפחות נקבה אחת וזכר אחד נכללים ככל הנראה. בניסויים לעיל השתמשנו בעוברים המבטאים mRNA של ovo-A ב-PGCs (nanos>ovo-A, OvoA_OE עוברים) כפונדקאי אגמטי. מתוך 669 נקבות F1 ו-720 זכרי F1 שהופקו מזוגות ננו>אובו-A מושתלים, לא היה מנוס שמקורו ב-PGCs המארחים. מספר מוטנטים של אוסקר (osk) הם גם אגמטייםרגישים לטמפרטורה 20,21. מכיוון שמוטנט אוסק עם כדאיות הומוזיגוטית גבוהה והפנוטיפ האגמטי אינו זמין עוד, יצרנו מחדש את מוטנט ה-osk[8] missense20 על ידי עריכת גנום בסיוע CRISPR/Cas9. זבובים אלה היו אגמטיים לחלוטין (0 בורחים מתוך 230 נקבות ו -192 זכרים) ב -25 מעלות צלזיוס, אך כמה בורחים הגיחו ב -23 מעלות צלזיוס (1 מתוך 248 נקבות ו -1 מתוך 290 זכרים). ננו>אובו-A מומלצים אפוא כעוברים מארחים אגמטיים. מניות UASp-ovo-A ו- nanos-Gal4 13 יהיו זמינות בקרוב ממרכז המניות KYOTO Drosophila. איור 1: ציוד נדרש. (A) מערכת מיקרומניפולטור לאיסוף תאים והשתלתם. i) מיקרוסקופ הפוך, ii) מיקרומניפולטור מכני, iii) מזרק, iv) מחזיק נימי, v) סטופקוק תלת-כיווני, vi) מכשיר אדים, vii) מיקרוסקופ סטריאו. (ב) מזרק. (C) סטופקוק תלת-כיווני וצינורות סיליקון מחברים מזרק ומחזיק נימי. (D) מחט ומחזיק נימים מחוברים למיקרומניפולטור. (E) גביע לאיסוף עוברים עם צלחת לאיסוף עוברים (קוטר 6 ס”מ, גובה 7.7 ס”מ). (F) מסננת רשת מנירוסטה. (ז) מכל המשמש כתא לח עם מגלשת זכוכית. כדי לשמור על לחות, הניחו נייר רטוב על התחתית וסגרו את המכסה. (ח) מחזיק מחט עם מחט להקפאה. (I) מתלה אחסון להקפאה וקופסה עם מחטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: מגלשת זכוכית מאוסף PGC ומחט לשימור קריוגני. (A) שקופית זכוכית מאוסף תאי נבט קדמוניים (PGC) המצופה בדבק. עוברים דכוריוניים מיושרים בשתי שורות ומכוונים כאשר הקדמי שלהם ימינה (הצד שיש לטפל בו) והצד הגחוני למעלה. מסגרת בריכת עוברים מוצמדת, שתי טיפות של תמיסת חומרים מגנים על הקפאה (CPA) מופקדות, והבריכה מלאה בשמן סיליקון. (B) מחט צריכה להכיל כמות קטנה ככל האפשר של חלמון ומזהמים אחרים. PGCs נדחקים בין שתי שכבות של שמן סיליקון כאשר הם נשמרים בהקפאה בחנקן נוזלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: יצירת המחט. שיטת ליטוש חוד תלת שלבית ליצירת מחט בגודל חור מתאים וקצה חד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: סכימת איסוף עוברים. לאחר שני אוספים מקדימים, אנו בדרך כלל אוספים שלוש או ארבע פעמים ביום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: יישור עובר מארח. יישור העוברים המארחים על שקופית זכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: סקירה כללית של שיטת PGC cryopreservation. סקירה כללית של כל השלבים שבוצעו לביצוע שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים (PGC). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. לחות בחדר < 30% ~ 30% > 30% יישור עוברים מארחים(~ 20 דקות) יש להשתמש במכשיר אדים למשך 2 – 10 דקות יש להשתמש במכשיר אדים לסירוגין למשך דקה אחת אין להשתמש במכשיר אדים הפשרת PGCs מתורם לא ישים לא ישים לא ישים PGCs יבשים באוויר השמט שלב זה השמט שלב זה 5 דקות מרחו שמן סיליקון לא ישים לא ישים לא ישים PGCs להשתלה לא ישים לא ישים לא ישים כל השלבים האלה צריכים להיות finshed בתוך 50 דקות. טבלה 1: ייבוש עוברים במהלך יישור העוברים והפשרת PGC. זן התורם תקופת שימור בהקפאה מספר עוברים מושתלים (A) מספר הזחלים שבקעו (B)(בקיעה, ב/א) מספר המבוגרים הסגורים (C)(כדאיות ביצה לבוגר, C/A) מספר הבוגרים הפוריים (D)(תדירות הזבובים הפוריים, D/C) M17 8 – 30 ימים 134 108(80.6%) 57(42.5%) 20(35.1%) M17 31 – 150 ימים 74 60(81.1%) 30(40.5%) 8(26.7%) M17: yw; TM6B, P{Dfd-GMR-nvYFP}4, Sb[1] Tb[1] ca[1]/ Pri[1] טבלה 2: יעילות השתלת PGC בהקפאה. טבלה זו השתנתה מ- 13. כל הנתונים הם ממארחים אגמטיים.

Discussion

גורם קריטי להצלחה בשימור הקפאה והחייאת PGC הוא שימוש בעוברים טובים. יש להשתמש בנקבות צעירות (למשל, בנות 3 עד 5 ימים) לאיסוף עוברים. הן העובר התורם והן העובר המארח מוערכים על ידי בדיקה מיקרוסקופית, ורק אלה בשלב הבלסטודרם (שלב 5) משמשים12. עבור איסוף PGC, אנו בדרך כלל מיישרים כ -40 עוברים תורמים בתקופה של 20 דקות ואוספים PGC מכ -30 עוברים בשלב מוקדם 5; לא נעשה שימוש בעוברים ישנים ופגומים. לאחר שימור בהקפאה והפשרה, PGCs צריכים לשמור על צורתם; PGCs נקרעים בשימור לא מוצלח. עוברים מארחים צריכים להיות גם בשלב 5 ויש להם לחץ פנימי מתון; העוברים צריכים לחזור לאט לאט לצורתם המקורית לאחר דרבון עדין. עוברים מיובשים מדי ולא יבשים מספיק לא יתפתחו באופן נורמלי לאחר ההשתלה. מכיוון שהשתלה הטרוסקסואלית של PGCs אינה מצליחה לייצר גמטות בדרוזופילה 5,10, השתלת PGCs מעוברים מרובים מתורמים לעוברים מארחים היא בעלת סיכוי גבוה יותר להניב מבוגרים פוריים. לשם כך, אנו בדרך כלל אוספים PGCs מכ -30 עוברים לכל מחט.

כהגנה קריואקטיבית, ניסינו אתילן גליקול, דימתיל סולפוקסיד וגליצרול יחד עם סוכרוז בריכוזים שונים. קבענו EBR המכיל 20% אתילן גליקול ו 1 M סוכרוז להיותהטוב ביותר 13; עם זאת, השימוש במגני קריופרוטקציה שונים עשוי לשפר את שימור PGC22.

שיטת שימור הקפאה זו דורשת מיומנויות מיוחדות בטיפול ב-PGC, ויש צורך בכ-6 שבועות של הכשרה כדי לאסוף ולהשתיל PGC בנוחות. כדי להעריך ולשפר מיומנות, ניתן לחלק זאת לשישה שלבי אימון: 1) יישור עוברים על מגלשת זכוכית, 2) שליטה במניפולטור, 3) השתלת PGCs מעובר לעובר אחר ללא הקפאה, 4) השתלת PGCs מ-10 עוברים או יותר ל-5 עד 10 עוברים, 5) השתלת PGCs לאחר החלת CPA, ו-6) השתלת PGCs לאחר הפשרת הקפאה. כל שלב עשוי להימשך שבוע. המטרות קצרות הטווח בשלב 3 הן שיעור בקיעה של 40%, כדאיות עובר לבוגר של 10%-20%, ותדירות של זבובים פוריים של 20%.

שימור קריוגני PGC דורש מכשור יקר וכוח אדם מיומן. לכן, שיטה זו לא יכולה להיות מאומצת על ידי מעבדות רבות. עם זאת, לשיטת PGC הנוכחית יש מספר היבטים חשובים. ראשית, PGCs קטנים בהרבה מעוברים והם חדירים מאוד להקפאה. לעומת זאת, חדירות ההגנה הקפאית מוגבלת מאוד על ידי שכבות השעווה של עוברי דרוזופילה, שהיא הבעיה החמורה ביותר בשימור עוברים בהקפאה. ואכן, מחקרים קודמים עשו מאמצים רבים למצוא חלון זמן שבו לעוברים יש שיעור הישרדות גבוה ושכבת שעווה דקה יותר. השני עוסק בשונות התפתחותית ומורפולוגית בין זנים. PGCs נאספים מעוברים בשלב מוקדם -5 (2 שעות 30 דקות-3 שעות 20 דקות לאחר הטלת ביצית), בעוד ששימור בהקפאה של עוברים מתבצע בשלב 16 עוברים (14-22 שעות לאחר הטלת ביציות). העוברים הם, אם כן, מבוגרים בהרבה ומראים שונות זן גדולה בהרבה בחלון הזמן האופטימלי לשימור בהקפאה בהשוואה לשימור בהקפאה PGC. ואכן, התדירות של פונדקאים המייצרים צאצאים שמקורם בתורם לא השתנתה בין חמישה זנים שנחקרו על ידי Asaoka et al.13, אם כי המארחים לא היו אגמטיים. יתר על כן, ל-PGCs יש פוטנציאל לשמש ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום 14,15,16.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים למרכז המניות KYOTO Drosophila על זני הזבובים. אנו מודים גם לגב’ וונדה מיאטה על עריכת כתב היד בשפה האנגלית ולד”ר ג’רמי אלן מאדנז (https://jp.edanz.com/ac) על עריכת טיוטה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) מהסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED) ל- T.T.-S.-K., מענקים (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) מ- AMED ל- S.K., מענק (JP20km0210172) מ- AMED ל- T.T.-S.-K. ו-S.K., מענק סיוע למחקר מדעי (C) (JP19K06780) מהאגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) ל-T.T.-S.-K., ומענק סיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (JP18H05552) מ-JSPS ל-S.K.

Materials

Acetic acid FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 017-00256 For embryo collection
Agar powder FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 010-08725 For embryo collection
Calcium chloride FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 038-24985 For EBR solution
Capillary Sutter Instrument B100-75-10-PT BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs
Capillary holder Eppendorf 5196 081.005 Capillary holder 4; for micromanipulation
Chromic acid mixture FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 037-05415 For needle washing
CPA solution 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose
Double-sided tape 3M Scotch w-12 For glue extracting
Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9
Ethanol (99.5) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 057-00451 For embryo collection
Ethylene glycol FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 054-00983 For CPA solution
Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish Corning Inc. 351006 For embryo collection
Forceps Vigor Type5 Titan For embryo handling
Grape juice Asahi Soft Drinks Co., LTD. Welch's Grape 100 For embryo collection
Grape juice agar plate 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid
Heptane FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 084-08105 For glue extracting
Humidifier APIX INTERNATIONAL CO., LTD. FSWD2201-WH For embryo preparation
Inverted microscope Leica Microsystems GmbH Leica DM IL LED For micromanipulation
Luer-lock glass syringe Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. 0550 14 71 08 Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation
Mechanical micromanipulator Leica Microsystems GmbH For micromanipulation
Micro slide glass Matsunami Glass Ind., Ltd. S-2441 For embryo aligning
Microgrinder NARISHIGE Group Custom order EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation
Microscope camera Leica Microsystems GmbH Leica MC170 HD For micromanipulation
Needle holder Merck KGaA Eppendorf TransferTip (ES) For cryopreservation
Potassium chloride Nacalai Tesque, Inc. 28514-75 For EBR solution
Puller NARISHIGE Group PN-31 For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0.
PVC adhesive tape for electric insulation Nitto Denko Corporation  J2515 For embryo-pool frame
Silicon oil Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. FL-100-450CS For embryo handling
Sodium chloride Nacalai Tesque, Inc. 31320-05 For EBR solution
Sodium hypochlorite solution FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 197-02206 Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching
Sucrose Nacalai Tesque, Inc. 30404-45 For CPA solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
  2. Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
  3. Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
  4. Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
  5. Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
  6. Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
  7. Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
  8. Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
  9. Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
  10. Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
  11. Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
  12. Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
  13. Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
  14. Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
  15. Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
  16. Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
  17. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).
  18. Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
  19. Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
  20. Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
  21. Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genetics. 153 (2), 799-812 (1999).
  22. Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).

Tags

Primordial Germ CellCryopreservationDrosophila StrainsGenetic EngineeringXenotransplantationGenetic ChangesLong-term PreservationEmbryo CryopreservationGermline Stem CellsGenetic Deterioration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nishimura, K., Asaoka, M., Sakamaki, Y., Fukumoto, T., Tanaka, D., Kobayashi, S., Takano-Shimizu-Kouno, T. Primordial Germ Cell Cryopreservation and Revival of Drosophila Strains. J. Vis. Exp. (202), e65985, doi:10.3791/65985 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image