緑膿菌によって産生されるモノラムノリピッドおよびジラムノリピッドの検出と定量
Summary
緑膿菌はラムノリピッドバイオサーファクタントを産生します。薄層クロマトグラフィーは、各菌株によって産生されるモノラムノ脂質とジラムノリピッドの割合を検出し、決定します。総ラムノリピドの定量には、培養上清から抽出されたこれらのバイオサーファクタントに存在するラムノース当量をオルシノール法を用いて評価することが含まれます。
Abstract
環境細菌 Pseudomonas aeruginosa は、健康被害を表す高い抗生物質耐性を持つ日和見病原体です。この細菌は、ラムノリピッド(RL)として知られるバイオサーファクタントを高レベルで生成しますが、これはバイオテクノロジー上の大きな価値を持つ分子ですが、病原性形質にも関連しています。この点で、RLの検出と定量は、バイオテクノロジーアプリケーションと生物医学研究プロジェクトの両方に役立つ可能性があります。本稿では、 緑膿菌 が産生する2種類の液性RLの産生を、単鎖脂質(mRL)という1つのラムノース部分に結合した脂肪酸(主にC10-C10)の二量体で構成する分子と、2つのラムノース結合体に結合した類似の脂肪酸二量体で構成する分子であるジラムノリピッド(dRL)の産生を、薄膜クロマトグラフィー(TLC)を用いて検出する手法を段階的に示します。さらに、 緑膿菌 培養上清から抽出したこれらのバイオサーファクタントの酸加水分解と、その後のオルシノールと反応するラムノースの濃度の検出に基づいて、RLの総量を測定する方法を紹介します。両方の手法の組み合わせを使用して、PAO1(系統群1)、PA14(系統群2)、およびPA7(系統群3)のタイプ株でここで例示されるように、特定の株によって産生されるmRLおよびdRLのおおよその濃度を推定することができます。
Introduction
緑膿菌は環境細菌であり、病原性に関連する形質の産生と高い抗生物質耐性により、非常に懸念される日和見病原体です1,2。この細菌によって産生される特徴的な二次代謝産物はバイオサーファクタントRLであり、これは酸化還元活性を持つ抗生物質であるフェナジンピオシアニンやプロテアーゼエラスターゼ3など、いくつかの病原性関連形質と協調して産生されます。RLの張力活性および乳化特性は、さまざまな産業用途で利用されており、現在商品化されています4。
ほとんどの緑膿菌株は、系統群1および2に属し、主に10個の炭素からなる脂肪酸二量体に結合した1つのラムノース部分からなるmRLと、最初のラムノース4に結合した追加のラムノース部分を含むdRLの2種類のRLを産生します(図1を参照)。しかし、緑膿菌の2つのマイナーな系統群(グループ3および5)は、mRL5,6のみを産生することが報告されています。2種類のRLには、前述のように主にC10-C10である脂肪酸二量体の混合物が含まれていますが、C12-C10、C12-C12、およびC10-C12:1二量体を含む分子の割合も小さくなります。HPLC MS/MSを用いた異なる株によって産生されるRL同族体の特性評価が報告されています7,8。この研究で説明されている方法は、mRLとdRLを区別することしかできず、RL同族体の特性評価には使用できません。
P. aeruginosaと一部のBurkholderia種はRL9の天然生産者ですが、前者の細菌が最も効率的な生産者です。しかし、市販されているRLは、現在、緑膿菌遺伝子を発現するPseudomonas putida KT2440誘導体で産生されており、この日和見病原体の使用を回避しています10,11。緑膿菌が産生するRLの検出と定量は、病原性関連形質の発現に関与する分子メカニズムの研究12、クレード3または5に属する株の特性評価13、およびこれらのバイオサーファクタントを過剰に産生し、病原性を低下させる緑膿菌の誘導体を構築するために非常に重要です14.異なる微生物によるバイオサーファクタントの産生は、これらの化合物のいくつかの一般的な特性、例えば、崩壊滴法や乳化指数15に基づいて検出されてきたが、これらの方法は正確でも特異でもない16。
ここでは、 緑膿菌タイプの異なる菌株の培養上清から全RLを液抽出し、TLCを用いて両タイプのRLを分離する方法を用いて、mRLとdRLを検出するプロトコールについて述べる。この方法では、培養上清から抽出されたRLは、TLCに使用される溶媒への溶解度によって分離され、シリカゲルプレート上での移動差を引き起こします。したがって、mRLはdRLよりも急速に移動し、プレートを乾燥させてα-ナフトールで染色すると、別々のスポットとして検出できます。
ここで説明するTLCによるmRLおよびdRLの検出方法は、以前に公開された記事17に基づいており、実行が容易で高価な機器を必要としません。この方法は、緑膿菌由来の変異体がRLを産生できないなど、適切な制御を用いて種々の緑膿菌分離株13中のRLを検出するのに有用である。しかし、緑膿菌以外の細菌が産生する新規バイオサーファクタントの特性評価には、特異性がないため好ましい方法ではありません。
さらに、緑膿菌培養上清から抽出された総RLのラムノース当量を定量化する方法が提示されます。この方法は、オルシノールと還元糖との反応に基づいてこれらのバイオサーファクタントを定量し、前述のように421nmで分光光度法で測定できる生成物をもたらす18。オルシノールとの反応はラムノースに特異的ではないため、リポ多糖類(LPS)などの他の糖含有分子をあまり含まない培養上清から抽出したRLを使用してこの方法を実行することが重要です。ここでは、RLの液体抽出18に酸性化クロロホルム/メタノール混合物が使用されているが、酢酸エチルも使用でき、固相抽出(SPE)は非常に良好な結果をもたらす19。ここで説明するオルシノール法は、高度な機器を必要とせず、分析されたサンプルの調製に特別な注意を払って行えば、信頼性の高い結果を得ることができます。適切なサンプル調製を確実にするためには、RL20を産生できないPseudomonas aeruginosa rhlA変異体を含め、各測定に対して3回の生物学的反復と3回の技術的反復を行うことが重要です。
文献16,21では、オルシノール法によるRL測定に関して大きな論争があり、一部の研究では、RL産生が過大評価されており、アッセイはラムノースに対する特異性を欠いており、他の糖を検出する可能性があることが示唆されています。ただし、ここでは、説明されている方法が適切な条件下で正確かつ特異的であることを示しています。さらに、本稿で概説した手順との比較のために、dRL標準のUPLC-MS/MS検出を利用し、オルシノール法でも同様の結果が得られることを実証します。この方法を使用してRLを定量するための詳細なプロトコルは、補足ファイル1に含まれています。
これらのプロトコルは、タイプ株PAO1(phylogroup 1)、PA14(phylogroup 2)、およびPA7(phylogroup 3)を用いて例示される。これらの株が選ばれたのは、特性が十分に評価され、異なるRLプロファイルを生成するためです。
Protocol
Representative Results
Discussion
RLを検出および定量するための最も正確な方法は、質量分析(MS)と組み合わせたHPLCです7,8,27;ただし、多くの研究者がアクセスできない可能性のある専門的で高価な機器が必要です。ここで説明する方法は、基本的な実験室の材料や機器を使用してRL濃度を検出および推定するために日常的に実行できますが、いくつかの制?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
GSChの研究室は、Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAMからの助成金IN201222によって部分的にサポートされています。
Materials
| 1-NAPHTHOL | SIGMA-ALDRICH | 70442 | |
| ACETIC ACID | J.T. BAKER | 9508-02 | |
| CENTRIFUGE | For centrifuging tubes 1.5 mL and 50 mL | ||
| CHLOROFORM | J.T. BAKER | 9180-02 | |
| DRYING OVEN | |||
| ETHER | J.T. BAKER | 9244-02 | |
| GLASS PIPETTE | SIGMA-ALDRICH | CLS706510 | |
| HYDROCHLORIC ACID | J.T. BAKER | 5622-02 | |
| LB | |||
| L-RHAMNOSE MONOHYDRATE | SIGMA-ALDRICH | R-3875 | |
| METHANOL | J.T. BAKER | 9049-02 | |
| ORCINOL MONOHYDRATE | SIGMA-ALDRICH | O1875 | |
| PPGAS Broth | Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M), Peptone (1%), pH 7.4 Autoclaved. Add Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M) | ||
| QUARTZ CELL (CUVETTE) | SIGMA-ALDRICH | Z276669 | |
| RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK | FISHER SCIENTIFIC | K4161801020 | |
| RHAMNOLIPIDS | SIGMA-ALDRICH | R-90 | |
| SPECTROPHOTOMETER | VIS | ||
| SPRAYER | SIGMA-ALDRICH | Z529710-1EA | |
| SULFURIC ACID | J.T. BAKER | 9681-02 | |
| TES TUBES 5mL | CORNING | 352002 | |
| TLC SILICA GEL 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| WATER BATH | > 80 °C |
References
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