Summary

Détection et quantification des mono-rhamnolipides et des di-rhamnolipides produits par Pseudomonas aeruginosa

Published: March 29, 2024
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Summary

Pseudomonas aeruginosa produit les biosurfactants rhamnolipides. La chromatographie sur couche mince détecte et détermine la proportion de mono- et di-rhamnolipides produits par chaque souche. La quantification des rhamnolipides totaux consiste à évaluer les équivalents de rhamnose présents dans ces biosurfactants extraits des surnageants de culture à l’aide de la méthode de l’orcinol.

Abstract

La bactérie environnementale Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste à forte résistance aux antibiotiques qui représente un danger pour la santé. Cette bactérie produit des niveaux élevés de biosurfactants connus sous le nom de rhamnolipides (RL), qui sont des molécules ayant une valeur biotechnologique significative mais qui sont également associées à des traits de virulence. À cet égard, la détection et la quantification de l’apprentissage par renforcement peuvent être utiles tant pour les applications biotechnologiques que pour les projets de recherche biomédicale. Dans cet article, nous montrons étape par étape la technique permettant de détecter la production des deux formes de RL produites par P. aeruginosa à l’aide de la chromatographie sur couche mince (CCM) : les mono-rhamnolipides (mRL), molécules constituées d’un dimère d’acides gras (principalement C10-C10) lié à une fraction rhamnose, et les di-rhamnolipides (dRL), molécules constituées d’un dimère d’acide gras similaire lié à deux fractions de rhamnose. De plus, nous présentons une méthode pour mesurer la quantité totale de RL basée sur l’hydrolyse acide de ces biosurfactants extraits d’un surnageant de culture de P. aeruginosa et la détection ultérieure de la concentration de rhamnose qui réagit avec l’orcinol. La combinaison des deux techniques peut être utilisée pour estimer la concentration approximative de mRL et de dRL produite par une souche spécifique, comme illustré ici avec les souches types PAO1 (phylogroupe 1), PA14 (phylogroupe 2) et PA7 (phylogroupe 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie environnementale et un pathogène opportuniste très préoccupant en raison de sa production de traits associés à la virulence et de sa forte résistance aux antibiotiques 1,2. Un métabolite secondaire caractéristique produit par cette bactérie est le biosurfactant RL, qui est produit de manière coordonnée avec plusieurs traits associés à la virulence tels que la phénazine pyocyanine, un antibiotique à activité redox et la protéase élastase3. Les propriétés tensio-actives et émulsifiantes de RL ont été exploitées dans différentes applications industrielles et sont actuellement commercialisées4.

La plupart des souches de P. aeruginosa, appartenant aux phylogroupes 1 et 2, produisent deux types de RL : mRL, qui consiste en un fragment de rhamnose lié à un dimère d’acide gras principalement de 10 atomes de carbone, et dRL, qui contient un fragmentaire de rhamnose supplémentaire lié au premier rhamnose4 (voir figure 1). Cependant, il a été rapporté que deux phylogroupes mineurs de P. aeruginosa (groupes 3 et 5) ne produisent quemRL 5,6. Les deux types de RL contiennent un mélange de dimères d’acides gras, qui, comme nous l’avons mentionné, sont principalement en C10-C10, mais de plus petites proportions de molécules contenant des dimères en C12-C10, C12-C12 et C10-C12:1 sont également produites. La caractérisation des congénères RL produits par différentes souches à l’aide de la HPLC MS/MS a été rapportée 7,8. Les méthodes décrites dans ce travail ne peuvent faire la différence entre mRL et dRL mais ne peuvent pas être utilisées pour la caractérisation des congénères RL.

P. aeruginosa et certaines espèces de Burkholderia sont des producteurs naturels de RL9, mais la première bactérie est le producteur le plus efficace. Cependant, la LR utilisée commercialement est actuellement produite dans les dérivés de Pseudomonas putida KT2440 exprimant les gènes de P. aeruginosa pour éviter l’utilisation de cet agent pathogène opportuniste10,11. La détection et la quantification de la LR produite par P. aeruginosa sont d’une grande importance pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression des caractères liés à la virulence12, dans la caractérisation des souches appartenant aux clades 3 ou 513, et pour la construction de dérivés de P. aeruginosa qui surproduisent ces biosurfactants tout en ayant une virulence réduite14. La production de biosurfactants par différents micro-organismes a été détectée sur la base de certaines caractéristiques générales de ces composés, telles que la méthode de la goutte d’effondrement ou l’indice d’émulsification15, mais ces méthodes ne sont ni précises ni spécifiques16.

Ici, nous décrivons le protocole de détection des mRL et dRL en utilisant l’extraction liquide des RL totaux des surnageants de culture de différentes souches de type P. aeruginosa et la séparation des deux types de RL à l’aide de la TLC. Dans cette méthode, le RL extrait du surnageant de culture est séparé par sa solubilité différentielle dans les solvants utilisés pour la CCM, provoquant une migration différentielle sur la plaque de gel de silice. Ainsi, les mRL ont une migration plus rapide que les dRL, et ils peuvent être détectés comme des points séparés lorsque les plaques sont séchées et colorées avec du α-naphtol.

La méthode décrite ici pour détecter mRL et dRL par TLC est basée sur un article17 précédemment publié, qui est facile à réaliser et ne nécessite pas d’équipement coûteux. Cette méthode s’est avérée utile pour détecter le RL dans divers isolats de P. aeruginosa 13 à l’aide de témoins appropriés, tels qu’un mutant dérivé de P. aeruginosa incapable de produire un RL. Cependant, ce n’est pas la méthode privilégiée pour caractériser les nouveaux biosurfactants produits par des bactéries autres que Pseudomonas aeruginosa en raison de son manque de spécificité.

De plus, une méthode de quantification des équivalents de rhamnose de la LR totale extraite d’un surnageant de culture de P. aeruginosa est présentée. Cette méthode quantifie ces biosurfactants en fonction de la réaction de l’orcinol avec les sucres réducteurs, ce qui permet d’obtenir un produit qui peut être mesuré par spectrophotométrie à 421 nm, comme décrit précédemment18. Étant donné que la réaction avec l’orcinol n’est pas spécifique au rhamnose, il est important d’effectuer cette méthode avec le RL extrait du surnageant de culture qui ne contient pas de quantités significatives d’autres molécules contenant du sucre, telles que les lipopolysaccharides (LPS). Un mélange chloroforme/méthanol acidifié est utilisé ici pour l’extraction liquide du RL18, mais l’acétate d’éthyle peut également être utilisé, et l’extraction en phase solide (SPE) donne de très bons résultats19. La méthode orcinol décrite ici ne nécessite pas d’équipement sophistiqué et peut fournir des résultats fiables si elle est effectuée avec un soin particulier dans la préparation des échantillons analysés, comme nous l’avons vu. Pour assurer une bonne préparation de l’échantillon, il est important d’inclure un mutant de Pseudomonas aeruginosa rhlA incapable de produire RL20 et d’effectuer trois répétitions biologiques et trois répétitions techniques pour chaque détermination.

Il y a eu une controverse importante dans la littérature16,21 concernant la détermination de la RL par la méthode de l’orcinol, certaines études suggérant que la production de RL est surestimée et que le test manque de spécificité pour le rhamnose, ce qui pourrait permettre de détecter d’autres sucres. Cependant, nous démontrons ici que les méthodes décrites peuvent être précises et spécifiques dans des conditions appropriées. De plus, à des fins de comparaison avec les procédures décrites dans cet article, nous utilisons la détection UPLC-MS/MS d’un étalon dRL et démontrons que des résultats similaires sont obtenus avec la méthode orcinol. Le protocole détaillé de quantification de l’apprentissage par renforcement à l’aide de cette méthode est inclus dans le fichier supplémentaire 1.

Ces protocoles sont illustrés à l’aide des souches types PAO1 (phylogroupe 1), PA14 (phylogroupe 2) et PA7 (phylogroupe 3). Ces souches ont été choisies parce qu’elles sont bien caractérisées et produisent différents profils RL.

Protocol

Cette procédure est schématisée dans la figure supplémentaire 1. Les réactifs et l’équipement utilisés pour l’étude sont énumérés dans la table des matériaux. 1. Détection de mRL et dRL dans les surnageants de culture de P. aeruginosa à l’aide de la CCM Commencer avec le bouillon centrifugé de la souche d’intérêt P . aeruginosa , cultivé en milieu liquide p…

Representative Results

Dans le présent article, trois souches différentes de type P. aeruginosa ont été utilisées pour représenter trois phylogroupes, chacun ayant des niveaux de production de RL et des proportions variables de mRL et de dRL. Ces souches comprennent PAO1 (un isolat de plaie d’Australie, 195522), PA14 (un isolat de plante des États-Unis, 197723) et PA7 (un isolat clinique d’Argentine, 201024). En tant que témoin négatif, le mutant PAO1 rhlA…

Discussion

La méthode la plus précise pour détecter et quantifier la LR est la HPLC couplée à la spectrométrie de masse (MS)7,8,27 ; Cependant, cela nécessite de l’équipement spécialisé et coûteux qui n’est peut-être pas accessible à de nombreux chercheurs. Les méthodes décrites ici peuvent être couramment mises en œuvre avec du matériel et de l’équipement de laboratoire de base pour détecter et estimer les concen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le laboratoire de GSCh est soutenu en partie par des subventions IN201222 du Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM.

Materials

1-NAPHTHOL SIGMA-ALDRICH 70442
ACETIC ACID J.T. BAKER 9508-02
CENTRIFUGE For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM J.T. BAKER 9180-02
DRYING OVEN
ETHER J.T. BAKER 9244-02
GLASS PIPETTE SIGMA-ALDRICH CLS706510
HYDROCHLORIC ACID J.T. BAKER 5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE SIGMA-ALDRICH R-3875
METHANOL J.T. BAKER 9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE SIGMA-ALDRICH O1875
PPGAS Broth Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE) SIGMA-ALDRICH Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK FISHER SCIENTIFIC K4161801020
RHAMNOLIPIDS  SIGMA-ALDRICH R-90
SPECTROPHOTOMETER VIS
SPRAYER SIGMA-ALDRICH Z529710-1EA
SULFURIC ACID J.T. BAKER 9681-02
TES TUBES 5mL CORNING 352002
TLC SILICA GEL 60 F254 MERCK 1.05554.0001
WATER BATH > 80 °C

References

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González-Valdez, A., Hernández-Pineda, J., Soberón-Chávez, G. Detection and Quantification of Mono-Rhamnolipids and Di-Rhamnolipids Produced by Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (205), e65934, doi:10.3791/65934 (2024).

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