Rilevamento e quantificazione di mono-ramnolipidi e di-ramnolipidi prodotti da Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa è un batterio ambientale e un patogeno opportunista di grande preoccupazione a causa della sua produzione di tratti associati alla virulenza e della sua elevata resistenza agli antibiotici ^1,2. Un caratteristico metabolita secondario prodotto da questo batterio è il biotensioattivo RL, che viene prodotto in modo coordinato con diversi tratti associati alla virulenza come la fenazina piocianina, un antibiotico con attività redox, e la proteasi elastasi³. Le proprietà tensio-attive ed emulsionanti dell’RL sono state sfruttate in diverse applicazioni industriali e sono attualmente commercializzate⁴.

La maggior parte dei ceppi di P. aeruginosa, appartenenti ai filogruppi 1 e 2, produce due tipi di RL: mRL, che consiste in una porzione di ramnosio legata a un dimero di acidi grassi composto principalmente da 10 atomi di carbonio, e dRL, che contiene un’ulteriore porzione di ramnosio legata al primo ramnosio⁴ (vedi Figura 1). Tuttavia, è stato riportato che due filogruppi minori di P. aeruginosa (gruppi 3 e 5) producono solo mRL ^5,6. I due tipi di RL contengono una miscela di dimeri di acidi grassi, che, come detto, sono principalmente C10-C10, ma vengono prodotte anche proporzioni minori di molecole contenenti dimeri C12-C10, C12-C12 e C10-C12:1. La caratterizzazione dei congeneri RL prodotti da diversi ceppi utilizzando HPLC MS/MS è stata riportata ^7,8. I metodi descritti in questo lavoro possono solo distinguere tra mRL e dRL, ma non possono essere utilizzati per la caratterizzazione dei congeneri RL.

P. aeruginosa e alcune specie di Burkholderia sono produttori naturali di RL⁹, ma il primo batterio è il produttore più efficiente. Tuttavia, l’RL utilizzato commercialmente è attualmente prodotto in derivati di Pseudomonas putida KT2440 che esprimono geni di P. aeruginosa per evitare l’uso di questo patogeno opportunista^10,11. La rilevazione e la quantificazione dei RL prodotti da P. aeruginosa sono di grande importanza per lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nell’espressione dei caratteri correlati alla virulenza¹², nella caratterizzazione di ceppi appartenenti ai cladi 3 o 5¹³ e per la costruzione di derivati di P. aeruginosa che sovraproducono questi biotensioattivi pur avendo una ridotta virulenza¹⁴. La produzione di biotensioattivi da parte di diversi microrganismi è stata rilevata sulla base di alcune caratteristiche generali di questi composti, come il metodo della goccia di collasso o l’indice di emulsione¹⁵, ma questi metodi non sono né accurati né specifici¹⁶.

Qui, descriviamo il protocollo per rilevare mRL e dRL utilizzando l’estrazione liquida di RL totale dai surnatanti di coltura di diversi ceppi di tipo P. aeruginosa e la separazione di entrambi i tipi di RL utilizzando TLC. In questo metodo, l’RL estratto dal surnatante di coltura viene separato dalla sua solubilità differenziale nei solventi utilizzati per la TLC, causando una migrazione differenziale sulla piastra di gel di silice. Pertanto, i mRL hanno una migrazione più rapida rispetto ai dRL e possono essere rilevati come punti separati quando le piastre vengono asciugate e colorate con α-naftolo.

Il metodo qui descritto per rilevare mRL e dRL mediante TLC si basa su un articolo¹⁷ pubblicato in precedenza, che è facile da eseguire e non richiede apparecchiature costose. Questo metodo è stato utile per rilevare RL in vari isolati di P. aeruginosa ¹³ utilizzando controlli appropriati, come un mutante derivato da P. aeruginosa incapace di produrre RL. Tuttavia, non è il metodo preferito per caratterizzare nuovi biotensioattivi prodotti da batteri diversi da Pseudomonas aeruginosa a causa della sua mancanza di specificità.

Inoltre, viene presentato un metodo per quantificare gli equivalenti ramnosio dell’RL totale estratto da un surnatante di coltura di P. aeruginosa . Questo metodo quantifica questi biotensioattivi sulla base della reazione dell’orcinolo con gli zuccheri riduttivi, ottenendo un prodotto che può essere misurato spettrofotometricamente a 421 nm, come descritto in precedenza¹⁸. Poiché la reazione con l’orcinolo non è specifica per il ramnosio, è importante eseguire questo metodo con RL estratto dal surnatante di coltura che non contiene quantità significative di altre molecole contenenti zucchero, come i lipopolisaccaridi (LPS). Per l’estrazione liquida di RL¹⁸ viene utilizzata una miscela acidificata di cloroformio/metanolo, ma può essere utilizzato anche l’acetato di etile e l’estrazione in fase solida (SPE) produce ottimi risultati¹⁹. Il metodo dell’orcinolo qui descritto non richiede apparecchiature sofisticate e può fornire risultati affidabili se eseguito con particolare cura nella preparazione dei campioni analizzati, come discusso. Per garantire un’adeguata preparazione del campione, è importante includere un mutante di Pseudomonas aeruginosa rhlA incapace di produrre RL²⁰ ed eseguire tre repliche biologiche e tre repliche tecniche per ogni determinazione.

Ci sono state significative controversie in letteratura^16,21 riguardo alla determinazione di RL con il metodo dell’orcinolo, con alcuni studi che suggeriscono che la produzione di RL è sovrastimata e che il test manca di specificità per il ramnosio, rilevando potenzialmente altri zuccheri. Tuttavia, dimostriamo qui che i metodi descritti possono essere accurati e specifici nelle condizioni appropriate. Inoltre, per il confronto con le procedure descritte in questo articolo, utilizziamo il rilevamento UPLC-MS/MS di uno standard dRL e dimostriamo che risultati simili si ottengono con il metodo orcinolo. Il protocollo dettagliato per quantificare l’RL utilizzando questo metodo è incluso nel file supplementare 1.

Questi protocolli sono esemplificati utilizzando i ceppi tipo PAO1 (filogruppo 1), PA14 (filogruppo 2) e PA7 (filogruppo 3). Questi ceppi sono stati scelti perché sono ben caratterizzati e producono diversi profili RL.