JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65921
, , , , , , ,
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

Summary

Kan-beyin bariyeri (BBB), istikrarlı ve sağlıklı bir beyin ortamının sürdürülmesinde çok önemli bir role sahiptir. BBB disfonksiyonu birçok nörolojik hastalıkla ilişkilidir. Serebrovasküler patolojiyi, BBB bütünlüğünü ve BBB’nin genetik ve hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini araştırmak için BBB’nin 3 boyutlu, kök hücre türevli bir modelini geliştirdik.

Abstract

Kan-beyin bariyeri (BBB), merkezi sinir sisteminin (CNS) önemli bir fizyolojik bileşenidir, besinleri korur, atıkları temizler ve beyni patojenlerden korur. BBB’nin doğal bariyer özellikleri, nörolojik hastalıkları tedavi etmek için CNS’ye terapötik ilaç verilmesi için bir zorluk teşkil etmektedir. Bozulmuş BBB fonksiyonu nörolojik hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Serebral amiloid anjiyopati (CAA), serebral vaskülatürde amiloidin birikmesi ve riskli bir BBB’ye yol açması, Alzheimer hastalığının (AD) çoğu vakasında bir komorbiditedir ve BBB disfonksiyonunun veya bozulmasının nörodejenerasyonda rol oynayabileceğini düşündürür. İnsan BBB dokusuna sınırlı erişim nedeniyle, uygun BBB fonksiyonuna ve BBB dejenerasyonuna katkıda bulunan mekanizmalar bilinmemektedir. Bu sınırlamaları ele almak için, endotel hücrelerini, perisitleri ve astrositleri bir 3D matriste birleştirerek insan pluripotent kök hücre türevi bir BBB (iBBB) geliştirdik. iBBB, BBB’de bulunan anatomiyi ve hücresel etkileşimleri özetlemek için kendi kendine toplanır. iBBB’lerin amiloid ile tohumlanması, CAA’nın önemli yönlerini yakalar. Ek olarak, iBBB, genetik ve yaşam tarzının hastalık riskini nasıl etkilediğini araştırmak için serebrovasküler hastalık ve nörodejenerasyonda rol oynayan genetik ve çevresel faktörleri modüle etmek için esnek bir platform sunar. Son olarak, iBBB, CNS’ye terapötik iletimi optimize etmek için ilaç taraması ve tıbbi kimya çalışmaları için kullanılabilir. Bu protokolde, insan pluripotent kök hücrelerinden kaynaklanan üç tip hücrenin (endotel hücreleri, perisitler ve astrositler) farklılaşmasını, farklılaşmış hücrelerin iBBB’ye nasıl birleştirileceğini ve ekzojen amiloid kullanılarak CAA’nın in vitro olarak nasıl modelleneceğini açıklıyoruz. Bu model, hem biyolojik sadakate hem de deneysel esnekliğe sahip bir sistemle canlı insan beyin dokusunu incelemenin zorluğunun üstesinden gelir ve insan BBB’sinin ve nörodejenerasyondaki rolünün sorgulanmasını sağlar.

Introduction

Kan-beyin bariyeri (BBB), uygun nöronal fonksiyon için ideal bir ortam sağlamak için merkezi sinir sistemini (CNS) çevreden ayıran önemli bir mikrovasküler ağdır. Metabolik homeostazı 1,2,3,4 koruyarak, atıkları temizleyerek 4,5,6 ve beyni patojenlerden ve toksinlerdenkoruyarak 7,8 maddelerin CNS’ye akışını ve akışını düzenlemede kritik bir role sahiptir.

BBB’nin birincil hücre tipi endotel hücresidir (EC). Mezoderm soyundan türetilen endotel hücreleri, vaskülatür 1,9’un duvarlarını oluşturur. Mikrovasküler EC’ler, membranlarının 10,11,12,13,14 geçirgenliğini büyük ölçüde azaltmak için birbirleriyle sıkı bağlantılar oluştururken, besinlerin CNS’ye girip çıkmasını kolaylaştırmak için taşıyıcıları eksprese eder 1,4,12,14. Mikrovasküler EC’ler, mikrovasküler fonksiyonu ve homeostazı düzenleyen perisitler (PC’ler)-duvar hücreleri ile çevrilidir ve BBB’nin moleküllere ve bağışıklık hücrelerine geçirgenliğini düzenlemek için kritik öneme sahiptir 15,16,17. Majör bir glial hücre tipi olan astrosit, BBB’yi oluşturan son hücre tipidir. Astrosit uç ayakları EC-PC vasküler tüplerinin etrafını sararken, hücre gövdeleri beyin parankimine uzanarak nöronlar ve damar sistemi1 arasında bir bağlantı oluşturur. Farklı çözünen ve substrat taşıyıcıları, BBB fonksiyonu18,19,20,21’de kritik bir role sahip olan astrosit uç ayaklarında (örneğin, aquaporin 4 [AQP-4]) lokalizedir.

BBB, uygun beyin sağlığı fonksiyonunun sürdürülmesinde kritik öneme sahiptir ve Alzheimer hastalığı (AD)22,23,24,25, multipl skleroz 7,26,27,28, epilepsi 29,30 ve inme31,32 dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıkta BBB’nin işlev bozukluğu bildirilmiştir . Serebrovasküler anormalliklerin nörodejenerasyonda merkezi bir rol oynadığı ve iskemik ve hemorajik olaylara duyarlılığın artmasına katkıda bulunduğu giderek daha fazla kabul edilmektedir. Örneğin, AD hastalarının %90’ından fazlasında serebral amiloid anjiyopati (CAA), serebral vaskülatür boyunca amiloid β (Aβ) birikimi ile karakterize bir durumdur. CAA, BBB geçirgenliğini arttırır ve BBB fonksiyonunu azaltır, CNS’yi iskemi, hemorajik olaylar ve hızlandırılmış bilişsel gerilemeye karşı savunmasız bırakır33.

Yakın zamanda, bir 3D matriste kapsüllenmiş EC’leri, PC’leri ve astrositleri içeren, hasta kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen insan BBB’sinin in vitro bir modelini geliştirdik (Şekil 1A). iBBB, vasküler tüp oluşumu ve astrosit uç ayaklarının vaskülatür24 ile lokalizasyonu dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili etkileşimleri özetler. APOE4’ün aracılık ettiği CAA duyarlılığını modellemek için iBBB’yi uyguladık (Şekil 1B). Bu, APOE4’ün CAA’yı teşvik ettiği nedensel hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamamızı ve CAA patolojisini azaltan ve APOE4 farelerinde in vivo öğrenme ve hafızayı geliştiren terapötik stratejiler geliştirmek için bu içgörülerden yararlanmamızı sağladı24. Burada, BBB’yi insan iPSC’lerinden yeniden yapılandırmak ve CAA’yı in vitro modellemek için ayrıntılı bir protokol ve video eğitimi sunuyoruz.

Protocol

1. iPSC’leri iBBB hücrelerine ayırma NOT: Bu farklılaşma protokolleri daha önce Mesentier-Louro ve ark.34’te tanımlanmıştır. Hücre kültürü plakalarının kaplanmasıAzaltılmış büyüme faktörü (GF) membran matrisini gece boyunca 4 °C’de çözdürün. 500 μL bazal membran matrisini 49.5 mL DMEM ile seyreltin. Kaplama çözeltisinin erken polimerizasyonunu önlemek için bu çözeltiyi soğuk tutun. 6 oyuk…

Representative Results

Düzgün şekillendirilmiş bir iBBB, tek bir yarı saydam diskte katılaşır (Şekil 3A). iBBB’nin birkaç gün sonra ilk pipetlendiği yüzeyden ayrılması normaldir. Bu önlenemez, ancak medyayı değiştirirken yanlışlıkla iBBB’yi aspire etmemek için dikkatli olunursa, iBBB’nin düzgün oluşumu için büyük bir endişe kaynağı değildir. 24 saat sonra, eşit olarak dağılmış, tek hücreler parlak alan mikroskobu altında tanımlanabilir (Şekil 3B</stron…

Discussion

BBB disfonksiyonu bir komorbiditedir ve potansiyel olarak çok sayıda nörolojik hastalıkta bir neden veya şiddetlendirici faktördür 7,40,41. Bununla birlikte, nörovasküler hastalığı olan insanlarda BBB’nin işlev bozukluğu ve parçalanmasının altında yatan moleküler ve hücre biyolojisini incelemek neredeyse imkansızdır. Bu protokolde sunulan indüklenebilir-BBB (iBBB), vasküler tüp oluşumu ve astrosit uç a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer’s Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Girişimi, MJFF / ASAP Vakfı ve Amerika Beyin Hasarı Derneği tarafından desteklenmektedir. CG, NIH F31NS130909 tarafından desteklenmektedir. Şekil 1A , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns’: Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer’s disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Tags

Blood-brain BarrierIn Vitro ModelAlzheimer’s DiseaseNeurodegenerationCerebrovascular PathologyAPOE4AmyloidInduced Pluripotent Stem CellsPersonalized TherapyDrug Screening3D ModelBBB FunctionCerebral Amyloid Angiopathy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image