JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65921
, , , , , , ,
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

Summary

למחסום הדם-מוח (BBB) יש תפקיד מכריע בשמירה על סביבת מוח יציבה ובריאה. תפקוד לקוי של BBB קשור למחלות נוירולוגיות רבות. פיתחנו מודל תלת-ממדי, הנגזר מתאי גזע של BBB כדי לחקור פתולוגיה של כלי דם במוח, שלמות BBB, וכיצד BBB משתנה על ידי גנטיקה ומחלות.

Abstract

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מרכיב פיזיולוגי מרכזי במערכת העצבים המרכזית (CNS), השומר על חומרי מזון, מפנה פסולת ומגן על המוח מפני פתוגנים. תכונות המחסום הטבועות ב- BBB מציבות אתגר להעברת תרופות טיפוליות למערכת העצבים המרכזית לטיפול במחלות נוירולוגיות. תפקוד לקוי של BBB נקשר למחלות נוירולוגיות. אנגיופתיה עמילואידית מוחית (CAA), שקיעת עמילואיד בכלי הדם במוח המובילה לפגיעה ב-BBB, היא תחלואה נלווית ברוב המקרים של מחלת אלצהיימר (AD), דבר המצביע על כך שתפקוד לקוי או פירוק של BBB עשויים להיות מעורבים בניוון עצבי. בשל גישה מוגבלת לרקמת BBB אנושית, המנגנונים התורמים לתפקוד תקין של BBB וניוון BBB נותרים בלתי ידועים. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, פיתחנו BBB שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (iBBB) על ידי שילוב תאי אנדותל, פריציטים ואסטרוציטים במטריצה תלת-ממדית. iBBB מתכנס בעצמו כדי לשחזר את האנטומיה ואת האינטראקציות התאיות הקיימות ב- BBB. זריעת iBBBs עם עמילואיד לוכדת היבטים מרכזיים של CAA. בנוסף, iBBB מציע פלטפורמה גמישה לווסת גורמים גנטיים וסביבתיים המעורבים במחלות כלי דם במוח וניוון עצבי, כדי לחקור כיצד גנטיקה ואורח חיים משפיעים על הסיכון למחלות. לבסוף, iBBB יכול לשמש להקרנת תרופות ומחקרי כימיה תרופתית כדי לייעל את המסירה הטיפולית למערכת העצבים המרכזית. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההתמיינות של שלושת סוגי התאים (תאי אנדותל, פריציטים ואסטרוציטים) הנובעים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, כיצד להרכיב את התאים המתמיינים לתוך iBBB, וכיצד למדל CAA במבחנה באמצעות עמילואיד אקסוגני. מודל זה מתגבר על האתגר של חקר רקמת מוח אנושית חיה באמצעות מערכת שיש לה גם נאמנות ביולוגית וגם גמישות ניסויית, ומאפשר לחקור את מחסום הדם-מוח האנושי ואת תפקידו בניוון עצבי.

Introduction

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא רשת כלי דם מרכזית המפרידה בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) לפריפריה כדי לשמור על סביבה אידיאלית לתפקוד עצבי תקין. יש לו תפקיד קריטי בוויסות הזרימה והזרימה של חומרים למערכת העצבים המרכזית על ידי שמירה על הומאוסטזיס מטבולי 1,2,3,4, פינוי פסולת 4,5,6, והגנה על המוח מפני פתוגנים ורעלים 7,8.

סוג התא העיקרי של BBB הוא תא אנדותל (EC). תאי אנדותל, שמקורם בשושלת המזודרם, יוצרים את קירות כלי הדם 1,9. ECs מיקרו-וסקולריים יוצרים צמתים הדוקים זה עם זה כדי להפחית באופן משמעותי את החדירות של הממברנה שלהם 10,11,12,13,14 תוך ביטוי טרנספורטרים כדי להקל על התנועה של חומרים מזינים לתוך והחוצה CNS 1,4,12,14. ECs מיקרו-וסקולריים מוקפים על ידי פריציטים (PC)-תאי קיר המווסתים את תפקוד כלי הדם והומאוסטזיס והם קריטיים לוויסות החדירות של BBB למולקולות ולתאי מערכת החיסון 15,16,17. האסטרוציט, סוג תא גליה עיקרי, הוא סוג התא הסופי המרכיב את BBB. רגלי קצה אסטרוציטים עוטפות את צינורות כלי הדם EC-PC בעוד גופי התא מתרחבים לתוך פרנכימה במוח, ויוצרים קשר בין נוירונים וכלי דם1. מובילי מומסים ומצע מובחנים ממוקמים על רגלי קצה אסטרוציטים (למשל, אקוופורין 4 [AQP-4]) שיש להם תפקיד קריטי בתפקוד BBB 18,19,20,21.

BBB הוא קריטי לשמירה על תפקוד תקין של בריאות המוח, ותפקוד לקוי של BBB דווח במחלות נוירולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר (AD)22,23,24,25, טרשת נפוצה 7,26,27,28, אפילפסיה29,30, ושבץ31,32. יותר ויותר מוכרים כי הפרעות בכלי הדם במוח ממלאות תפקיד מרכזי בניוון עצבי, התורמות לרגישות מוגברת לאירועים איסכמיים ודימומיים. לדוגמה, יותר מ -90% מחולי אלצהיימר סובלים מאנגיופתיה עמילואידית מוחית (CAA), מצב המאופיין בתצהיר של β עמילואיד (Aβ) לאורך כלי הדם במוח. CAA מגביר את החדירות של BBB ומקטין את תפקוד BBB, מה שמשאיר את מערכת העצבים המרכזית פגיעה לאיסכמיה, אירועים דימומיים וירידה קוגניטיבית מואצת33.

לאחרונה פיתחנו מודל במבחנה של BBB אנושי, המופק מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי מטופלים, אשר משלב ECs, מחשבים אישיים ואסטרוציטים עטופים במטריצה תלת-ממדית (איור 1A). iBBB משחזר אינטראקציות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, כולל היווצרות צינור כלי דם ולוקליזציה של כפות רגליים אסטרוציטים עם כלי דם24. יישמנו את iBBB כדי למדל את הרגישות של CAA בתיווך APOE4 (איור 1B). זה אפשר לנו לזהות את המנגנונים התאיים והמולקולריים הסיבתיים שבאמצעותם APOE4 מקדם CAA, ולמנף את התובנות האלה כדי לפתח אסטרטגיות טיפוליות המפחיתות פתולוגיה של CAA ומשפרות למידה וזיכרון in vivo בעכברי APOE424. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט ומדריך וידאו לשחזור BBB מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ומידול CAA במבחנה.

Protocol

1. התמיינות iPSCs לתאי iBBB הערה: פרוטוקולי בידול אלה תוארו בעבר ב- Mesentier-Louro et al.34. ציפוי לוחות תרבית תאיםהפשרה מטריצת קרום גורם גדילה מופחת (GF) למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס. לדלל 500 μL של מטריצת קרום מרתף ב 49.5 מ”ל של DMEM. שמור על תמיסה זו קרה כדי למנוע פיל?…

Representative Results

iBBB שנוצר כראוי מתמצק לדיסק שקוף יחיד (איור 3A). זה נורמלי עבור iBBB להתנתק מן פני השטח שעליו הוא היה pipeted לראשונה לאחר כמה ימים. לא ניתן להימנע מכך, אך אין זה חשש עיקרי להיווצרות נכונה של iBBB אם ננקטת זהירות בעת שינוי מדיה כדי לא לשאוף בטעות את iBBB. לאחר 24 שעות, בחלוקה שווה, ניתן לזהו?…

Discussion

תפקוד לקוי של BBB הוא תחלואה משותפת, ופוטנציאלית, גורם או גורם מחמיר במחלות נוירולוגיות רבות 7,40,41. עם זאת, זה כמעט בלתי אפשרי לחקור את הביולוגיה המולקולרית והתאית העומדת בבסיס תפקוד לקוי והתמוטטות של BBB בבני אדם עם מחלות נוירו-וסקולריות. ה- in…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, הקרן לריפוי אלצהיימר, נאס”א 80ARCO22CA004, יוזמת צ’אן-צוקרברג, MJFF/ASAP Foundation ואיגוד פגיעות המוח של אמריקה. C.G. נתמך על ידי NIH F31NS130909. איור 1A נוצר באמצעות BioRender.com.

Materials

6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns’: Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer’s disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Tags

Blood-brain BarrierIn Vitro ModelAlzheimer’s DiseaseNeurodegenerationCerebrovascular PathologyAPOE4AmyloidInduced Pluripotent Stem CellsPersonalized TherapyDrug Screening3D ModelBBB FunctionCerebral Amyloid Angiopathy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image