Реконструкция гематоэнцефалического барьера in vitro для моделирования и терапевтического воздействия на неврологические заболевания
Summary
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) играет решающую роль в поддержании стабильной и здоровой среды мозга. Дисфункция ГЭБ связана со многими неврологическими заболеваниями. Мы разработали 3D-модель ГЭБ на основе стволовых клеток для изучения цереброваскулярной патологии, целостности ГЭБ и того, как ГЭБ изменяется генетикой и заболеванием.
Abstract
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является ключевым физиологическим компонентом центральной нервной системы (ЦНС), поддерживая питательные вещества, очищая отходы и защищая мозг от патогенов. Барьерные свойства, присущие ГЭБ, создают трудности для доставки терапевтических препаратов в ЦНС для лечения неврологических заболеваний. Нарушение функции ГЭБ связано с неврологическими заболеваниями. Церебральная амилоидная ангиопатия (САА), отложение амилоида в сосудах головного мозга, приводящее к нарушению ГЭБ, является сопутствующим заболеванием в большинстве случаев болезни Альцгеймера (БА), что позволяет предположить, что дисфункция или распад ГЭБ могут быть вовлечены в нейродегенерацию. Из-за ограниченного доступа к тканям ГЭБ человека механизмы, способствующие правильному функционированию ГЭБ и дегенерации ГЭБ, остаются неизвестными. Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали ГЭБ, полученный из плюрипотентных стволовых клеток человека (iBBB), включив эндотелиальные клетки, перициты и астроциты в 3D-матрицу. iBBB самоорганизуется, чтобы повторить анатомию и клеточные взаимодействия, присутствующие в BBB. Посев iBBB амилоидом отражает ключевые аспекты CAA. Кроме того, iBBB предлагает гибкую платформу для модуляции генетических факторов и факторов окружающей среды, вовлеченных в цереброваскулярные заболевания и нейродегенерацию, чтобы исследовать, как генетика и образ жизни влияют на риск заболевания. Наконец, iBBB может быть использован для скрининга лекарственных препаратов и медико-химических исследований для оптимизации терапевтической доставки в ЦНС. В этом протоколе мы описываем дифференцировку трех типов клеток (эндотелиальных клеток, перицитов и астроцитов), возникающих из плюрипотентных стволовых клеток человека, как собрать дифференцированные клетки в iBBB и как смоделировать CAA in vitro с использованием экзогенного амилоида. Эта модель решает проблему изучения живой ткани человеческого мозга с помощью системы, которая обладает как биологической точностью, так и экспериментальной гибкостью, и позволяет исследовать человеческий ГЭБ и его роль в нейродегенерации.
Introduction
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является ключевой микрососудистой сетью, отделяющей центральную нервную систему (ЦНС) от периферии для поддержания идеальной среды для правильного функционирования нейронов. Он играет важнейшую роль в регулировании притока и оттока веществ в ЦНС, поддерживая метаболический гомеостаз 1,2,3,4, очищая отходы 4,5,6 и защищая мозг от патогенов и токсинов 7,8.
Первичным типом клеток ГЭБ является эндотелиальная клетка (ЭК). Эндотелиальные клетки, происходящие из мезодермы, образуют стенки сосудистой сети 1,9. Микрососудистые ЭК образуют плотные соединения друг с другом, чтобы значительно уменьшить проницаемость своей мембраны 10,11,12,13,14, в то же время экспрессируя транспортеры для облегчения движения питательных веществ в ЦНС и из ЦНС 1,4,12,14. Микрососудистые ЭК окружены перицитами (ПК) – клетками-стенками, которые регулируют функцию микрососудов и гомеостаз и имеют решающее значение для регуляции проницаемости ГЭБ для молекул и иммунных клеток 15,16,17. Астроцит, основной тип глиальных клеток, является последним типом клеток, составляющих ГЭБ. Концевые ножки астроцитов оборачиваются вокруг сосудистых трубок EC-PC, в то время как клеточные тела простираются в паренхиму мозга, образуя связь между нейронами и сосудистой сетью1. На концевых ножках астроцитов локализуются различные переносчики растворенных веществ и субстратов (например, аквапорин 4 [AQP-4]), которые играют решающую роль в функции ГЭБ 18,19,20,21.
ГЭБ имеет решающее значение для поддержания надлежащего функционирования мозга, и дисфункция ГЭБ была зарегистрирована при многих неврологических заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера (БА)22,23,24,25, рассеянный склероз 7,26,27,28, эпилепсию 29,30 и инсульт31,32. Все чаще признается, что цереброваскулярные аномалии играют центральную роль в нейродегенерации, способствуя повышенной восприимчивости к ишемическим и геморрагическим событиям. Например, более 90% пациентов с болезнью Альцгеймера имеют церебральную амилоидную ангиопатию (ЦАА), состояние, характеризующееся отложением амилоидной β (Aβ) вдоль сосудистой сети головного мозга. ЧАА увеличивает проницаемость ГЭБ и снижает функцию ГЭБ, делая ЦНС уязвимой к ишемии, геморрагическим событиям и ускоренномуснижению когнитивных функций.
Недавно мы разработали in vitro модель человеческого ГЭБ, полученную из индуцированных пациентом плюрипотентных стволовых клеток, которая включает в себя ЭК, ПК и астроциты, инкапсулированные в 3D-матрицу (рис. 1A). iBBB повторяет физиологически значимые взаимодействия, включая формирование сосудистых трубок и локализацию концевых ножек астроцитов с сосудистой сетью24. Мы применили iBBB для моделирования восприимчивости к CAA, опосредованной APOE4 (рис. 1B). Это позволило нам идентифицировать причинно-следственные клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых APOE4 способствует развитию CAA, и использовать эти знания для разработки терапевтических стратегий, которые уменьшают патологию CAA и улучшают обучение и память in vivo у мышей APOE424. Здесь мы приводим подробный протокол и видеоурок по реконструкции ГЭБ из ИПСК человека и моделированию САА in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Дисфункция ГЭБ является сопутствующим заболеванием и, возможно, причиной или усугубляющим фактором при многочисленных неврологических заболеваниях 7,40,41. Тем не менее, практически невозможно изучить молекулярную и клеточную биологию…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддержана NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Фондом лечения болезни Альцгеймера, NASA 80ARCO22CA004, Инициативой Чана-Цукерберга, Фондом MJFF/ASAP и Американской ассоциацией травм головного мозга. C.G. поддерживается NIH F31NS130909. Рисунок 1A был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| 6e10 amyloid-β antibody | Biolegend | SIG-39320 | Used at 1:1000 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Activin A | Peprotech | 20-14E | |
| Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies | Invitrogen | Various | Used at 1:1000 |
| Amyloid-beta 40 fibril | AnaSpec | AS-24235 | |
| Amyloid-beta 42 fibril | AnaSpec | AS-20276 | |
| Aquaporin-4 antibody | Invitrogen | PA5-53234 | Used at 1:300 |
| Astrocyte basal media and supplements | ScienCell | 1801 | |
| B-27 serum-free supplement | Gibco | 17504044 | |
| BMP4 | Peprotech | 120-05ET | |
| CHIR99021 | Cyamn Chemical | 13112 | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX medium | Gibco | 10565018 | |
| Doxycycline | Millipore-Sigma | D3072-1ML | |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Fluoromount-G slide mounting medium | VWR | 100502-406 | |
| Forskolin | R&D Systems | 1099/10 | |
| GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement | Gibco | A1413302 | |
| Glass Bottom 48-well Culture Dishes | Mattek Corporation | P48G-1.5-6-F | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Human Endothelial Serum-free medium | Gibco | 11111044 | |
| LDN193189 | Tocris | 6053 | |
| Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| N-2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Millipore-Sigma | S30-100mL | Use serum to match secondary antibody host |
| Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher | 28908 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 100-14B | |
| PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody | R&D Systems | AF385 | Used at 1:500 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010031 | |
| Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody | R&D Systems | AF806 | Used at 1:500 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) | AddGene | Catalog #168805 | |
| S100B antibody | Sigma-Aldrich | S2532-100uL | Used at 1:500 |
| SB43152 | Reprocell | 04-0010 | |
| Thioflavin T | Chem Impex | 22870 | Used at 25uM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250mL | |
| VE-cadherin (CD144) antibody | R&D systems | AF938 | Used at 1:500 |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254/10 | |
| ZO-1 | Invitrogen | MA3-39100-A488 | Dilution = 1:500 |
References
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
- Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
- Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
- Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
- Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
- Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns’: Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
- Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
- Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
- Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
- Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer’s disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
- Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
- Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
- Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
- Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
- Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
- Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
- Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
- Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
- Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
- Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
- Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
- Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
- Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
- Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
- Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
- Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
- Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).
