JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65921
, , , , , , ,
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

Summary

De bloed-hersenbarrière (BBB) speelt een cruciale rol bij het in stand houden van een stabiele en gezonde hersenomgeving. BBB-disfunctie wordt in verband gebracht met veel neurologische aandoeningen. We hebben een 3D, stamcel-afgeleid model van de BBB ontwikkeld om cerebrovasculaire pathologie, BBB-integriteit te onderzoeken en hoe de BBB wordt veranderd door genetica en ziekte.

Abstract

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een belangrijk fysiologisch onderdeel van het centrale zenuwstelsel (CZS), dat voedingsstoffen in stand houdt, afvalstoffen opruimt en de hersenen beschermt tegen ziekteverwekkers. De inherente barrière-eigenschappen van de BBB vormen een uitdaging voor therapeutische medicijnafgifte in het CZS om neurologische aandoeningen te behandelen. Een verminderde BBB-functie is in verband gebracht met neurologische aandoeningen. Cerebrale amyloïde angiopathie (CAA), de afzetting van amyloïde in de cerebrale vasculatuur die leidt tot een gecompromitteerde BBB, is een comorbiditeit in de meeste gevallen van de ziekte van Alzheimer (AD), wat suggereert dat BBB-disfunctie of -afbraak betrokken kan zijn bij neurodegeneratie. Vanwege de beperkte toegang tot menselijk BBB-weefsel blijven de mechanismen die bijdragen aan een goede BBB-functie en BBB-degeneratie onbekend. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een van menselijke pluripotente stamcellen afgeleide BBB (iBBB) ontwikkeld door endotheelcellen, pericyten en astrocyten in een 3D-matrix op te nemen. De iBBB assembleert zichzelf om de anatomie en cellulaire interacties in de BBB te recapituleren. Het zaaien van iBBB’s met amyloïd legt de belangrijkste aspecten van CAA vast. Daarnaast biedt de iBBB een flexibel platform om genetische en omgevingsfactoren die betrokken zijn bij cerebrovasculaire aandoeningen en neurodegeneratie te moduleren, om te onderzoeken hoe genetica en levensstijl het ziekterisico beïnvloeden. Ten slotte kan de iBBB worden gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen en medicinale chemische studies om de therapeutische afgifte aan het CZS te optimaliseren. In dit protocol beschrijven we de differentiatie van de drie soorten cellen (endotheelcellen, pericyten en astrocyten) die voortkomen uit menselijke pluripotente stamcellen, hoe de gedifferentieerde cellen in de iBBB kunnen worden samengevoegd en hoe CAA in vitro kan worden gemodelleerd met behulp van exogeen amyloïde. Dit model overwint de uitdaging om levend menselijk hersenweefsel te bestuderen met een systeem dat zowel biologische getrouwheid als experimentele flexibiliteit heeft, en maakt het mogelijk om de menselijke BBB en zijn rol in neurodegeneratie te ondervragen.

Introduction

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een belangrijk microvasculair netwerk dat het centrale zenuwstelsel (CZS) scheidt van de periferie om een ideale omgeving te behouden voor een goede neuronale functie. Het speelt een cruciale rol bij het reguleren van de instroom en uitstroom van stoffen in het CZS door de metabole homeostase 1,2,3,4 te handhaven, afvalstoffen 4,5,6 op te ruimen en de hersenen te beschermen tegen ziekteverwekkers en toxines 7,8.

Het primaire celtype van de BBB is de endotheelcel (EC). Endotheelcellen, afgeleid van de mesodermlijn, vormen de wanden van het vaatstelsel 1,9. Microvasculaire EC’s vormen tight junctions met elkaar om de permeabiliteit van hun membraan sterk te verminderen 10,11,12,13,14 terwijl transporters tot expressie worden gebracht om de beweging van voedingsstoffen in en uit het CZS te vergemakkelijken 1,4,12,14 . Microvasculaire EC’s worden omringd door pericyten (PC’s)-murale cellen die de microvasculaire functie en homeostase reguleren en van cruciaal belang zijn voor het reguleren van de permeabiliteit van de BBB voor moleculen en immuuncellen 15,16,17. De astrocyt, een belangrijk gliaceltype, is het uiteindelijke celtype waaruit de BBB bestaat. Astrocyten-eindvoeten wikkelen zich rond de EC-PC-vaatbuizen, terwijl de cellichamen zich uitstrekken tot in het hersenparenchym en een verbinding vormen tussen neuronen en vasculatuur1. Verschillende transporters van opgeloste stoffen en substraat zijn gelokaliseerd op astrocyt-eindvoeten (bijv. aquaporine 4 [AQP-4]) die een cruciale rol spelen in de BBB-functie 18,19,20,21.

De BBB is van cruciaal belang voor het handhaven van een goede hersengezondheidsfunctie, en disfunctie van de BBB is gemeld bij veel neurologische aandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD) 22,23,24,25, multiple sclerose 7,26,27,28, epilepsie29,30 en beroerte 31,32. Het wordt steeds meer erkend dat cerebrovasculaire afwijkingen een centrale rol spelen bij neurodegeneratie, wat bijdraagt aan een verhoogde gevoeligheid voor ischemische en hemorragische gebeurtenissen. Meer dan 90% van de AD-patiënten heeft bijvoorbeeld cerebrale amyloïde angiopathie (CAA), een aandoening die wordt gekenmerkt door de afzetting van amyloïde β (Aβ) langs het cerebrale vaatstelsel. CAA verhoogt de BBB-permeabiliteit en vermindert de BBB-functie, waardoor het CZS kwetsbaar wordt voor ischemie, hemorragische gebeurtenissen en versnelde cognitieve achteruitgang33.

We hebben onlangs een in vitro model van de menselijke BBB ontwikkeld, afgeleid van door de patiënt geïnduceerde pluripotente stamcellen, dat EC’s, PC’s en astrocyten bevat die zijn ingekapseld in een 3D-matrix (Figuur 1A). De iBBB recapituleert fysiologisch relevante interacties, waaronder vasculaire buisvorming en lokalisatie van astrocyt-eindvoeten met vasculatuur24. We pasten de iBBB toe om de gevoeligheid van CAA gemedieerd door APOE4 te modelleren (Figuur 1B). Dit stelde ons in staat om de causale cellulaire en moleculaire mechanismen te identificeren waarmee APOE4 CAA bevordert, en deze inzichten te gebruiken om therapeutische strategieën te ontwikkelen die CAA-pathologie verminderen en het leren en geheugen in vivo verbeteren in APOE4-muizen24. Hier bieden we een gedetailleerd protocol en video-tutorial voor het reconstrueren van de BBB uit menselijke iPSC’s en het modelleren van CAA in vitro.

Protocol

1. Differentiëren van iPSC’s in iBBB-cellen OPMERKING: Deze differentiatieprotocollen zijn eerder beschreven in Mesentier-Louro et al.34. Coaten van celkweekplatenOntdooi de membraanmatrix met gereduceerde groeifactor (GF) ‘s nachts bij 4 °C. Verdun 500 μL basale membraanmatrix in 49,5 ml DMEM. Houd deze oplossing koud om voortijdige polymerisatie van de coatingoplossing te voorkomen. Voeg 1-2 ml per putje toe van een me…

Representative Results

Een correct gevormde iBBB stolt tot een enkele doorschijnende schijf (Figuur 3A). Het is normaal dat de iBBB na een paar dagen loskomt van het oppervlak waarop hij voor het eerst werd gepipetteerd. Dit kan niet worden vermeden, maar is geen groot probleem voor de juiste vorming van de iBBB als er bij het wisselen van media op wordt gelet dat de iBBB niet per ongeluk wordt opgezogen. Na 24 uur kunnen onder een helderveldmicroscoop afzonderlijke cellen worden geïdentifice…

Discussion

BBB-disfunctie is een comorbiditeit en mogelijk een oorzaak of verergerende factor bij tal van neurologische aandoeningen 7,40,41. Het is echter bijna onmogelijk om de moleculaire en celbiologie te bestuderen die ten grondslag ligt aan de disfunctie en afbraak van de BBB bij mensen met neurovasculaire aandoeningen. De inducible-BBB (iBBB) die in dit protocol wordt gepresenteerd, biedt een in vitro systeem dat belangrijk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt ondersteund door NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer’s Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation en Brain Injury Association of America. CG wordt ondersteund door NIH F31NS130909. Figuur 1A is gemaakt met BioRender.com.

Materials

6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns’: Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer’s disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Tags

Blood-brain BarrierIn Vitro ModelAlzheimer’s DiseaseNeurodegenerationCerebrovascular PathologyAPOE4AmyloidInduced Pluripotent Stem CellsPersonalized TherapyDrug Screening3D ModelBBB FunctionCerebral Amyloid Angiopathy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image