Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica
Summary
La barriera emato-encefalica (BBB) ha un ruolo cruciale nel sostenere un ambiente cerebrale stabile e sano. La disfunzione della BBB è associata a molte malattie neurologiche. Abbiamo sviluppato un modello 3D derivato da cellule staminali della BBB per studiare la patologia cerebrovascolare, l’integrità della BBB e il modo in cui la BBB viene alterata dalla genetica e dalla malattia.
Abstract
La barriera emato-encefalica (BBB) è una componente fisiologica chiave del sistema nervoso centrale (SNC), che mantiene i nutrienti, elimina i rifiuti e protegge il cervello dagli agenti patogeni. Le proprietà di barriera intrinseche della BBB rappresentano una sfida per la somministrazione di farmaci terapeutici nel sistema nervoso centrale per il trattamento di malattie neurologiche. La compromissione della funzione della BBB è stata correlata a malattie neurologiche. L’angiopatia amiloide cerebrale (CAA), la deposizione di amiloide nella vascolarizzazione cerebrale che porta a una BBB compromessa, è una comorbilità nella maggior parte dei casi di malattia di Alzheimer (AD), suggerendo che la disfunzione o la rottura della BBB può essere coinvolta nella neurodegenerazione. A causa dell’accesso limitato al tessuto BBB umano, i meccanismi che contribuiscono alla corretta funzione e alla degenerazione della BBB rimangono sconosciuti. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una BBB derivata da cellule staminali pluripotenti umane (iBBB) incorporando cellule endoteliali, periciti e astrociti in una matrice 3D. L’iBBB si auto-assembla per ricapitolare l’anatomia e le interazioni cellulari presenti nella BBB. La semina di iBBB con amiloide cattura gli aspetti chiave della CAA. Inoltre, l’iBBB offre una piattaforma flessibile per modulare i fattori genetici e ambientali implicati nelle malattie cerebrovascolari e nella neurodegenerazione, per studiare come la genetica e lo stile di vita influenzano il rischio di malattia. Infine, l’iBBB può essere utilizzato per lo screening dei farmaci e gli studi di chimica farmaceutica per ottimizzare la somministrazione terapeutica al SNC. In questo protocollo, descriviamo la differenziazione dei tre tipi di cellule (cellule endoteliali, periciti e astrociti) derivanti da cellule staminali pluripotenti umane, come assemblare le cellule differenziate nell’iBBB e come modellare CAA in vitro utilizzando amiloide esogena. Questo modello supera la sfida di studiare il tessuto cerebrale umano vivo con un sistema che ha sia fedeltà biologica che flessibilità sperimentale, e consente di interrogare la BBB umana e il suo ruolo nella neurodegenerazione.
Introduction
La barriera emato-encefalica (BBB) è una rete microvascolare chiave che separa il sistema nervoso centrale (SNC) dalla periferia per mantenere un ambiente ideale per una corretta funzione neuronale. Ha un ruolo fondamentale nella regolazione dell’afflusso e dell’efflusso di sostanze nel sistema nervoso centrale mantenendo l’omeostasi metabolica 1,2,3,4, eliminando i rifiuti 4,5,6 e proteggendo il cervello da agenti patogeni e tossine 7,8.
Il tipo di cellula primaria della BBB è la cellula endoteliale (EC). Le cellule endoteliali, derivate dalla linea mesodermica, formano le pareti del sistema vascolare 1,9. Le EC microvascolari formano giunzioni strette tra loro per ridurre notevolmente la permeabilità della loro membrana 10,11,12,13,14 mentre esprimono trasportatori per facilitare il movimento dei nutrienti dentro e fuori il SNC 1,4,12,14. Le EC microvascolari sono circondate da periciti (PC) – cellule murali che regolano la funzione microvascolare e l’omeostasi e sono fondamentali per regolare la permeabilità della BBB alle molecole e alle cellule immunitarie 15,16,17. L’astrocita, un importante tipo di cellula gliale, è l’ultimo tipo di cellula che comprende la BBB. Le estremità degli astrociti si avvolgono attorno ai tubi vascolari EC-PC mentre i corpi cellulari si estendono nel parenchima cerebrale, formando una connessione tra neuroni e vascolarizzazione1. Trasportatori distinti di soluti e substrati sono localizzati sulle estremità degli astrociti (ad esempio, l’acquaporina 4 [AQP-4]) che hanno un ruolo critico nella funzioneBBB 18,19,20,21.
La BBB è fondamentale per mantenere la corretta funzione della salute del cervello e la disfunzione della BBB è stata segnalata in molte malattie neurologiche, tra cui il morbo di Alzheimer (AD) 22,23,24,25, la sclerosi multipla 7,26,27,28, l’epilessia 29,30 e l’ictus31,32. È sempre più riconosciuto che le anomalie cerebrovascolari svolgono un ruolo centrale nella neurodegenerazione, contribuendo ad aumentare la suscettibilità agli eventi ischemici ed emorragici. Ad esempio, oltre il 90% dei pazienti con AD ha angiopatia amiloide cerebrale (CAA), una condizione caratterizzata dalla deposizione di β amiloide (Aβ) lungo la vascolarizzazione cerebrale. La CAA aumenta la permeabilità della BBB e diminuisce la funzione della BBB, lasciando il SNC vulnerabile all’ischemia, agli eventi emorragici e al declino cognitivo accelerato33.
Recentemente abbiamo sviluppato un modello in vitro della BBB umana, derivato da cellule staminali pluripotenti indotte dal paziente, che incorpora EC, PC e astrociti incapsulati in una matrice 3D (Figura 1A). L’iBBB ricapitola le interazioni fisiologicamente rilevanti, tra cui la formazione del tubo vascolare e la localizzazione delle estremità degli astrociti con la vascolarizzazione24. Abbiamo applicato l’iBBB per modellare la suscettibilità alla CAA mediata da APOE4 (Figura 1B). Questo ci ha permesso di identificare i meccanismi cellulari e molecolari causali attraverso i quali APOE4 promuove la CAA e di sfruttare queste intuizioni per sviluppare strategie terapeutiche che riducano la patologia CAA e migliorino l’apprendimento e la memoria in vivo nei topi APOE424. Qui, forniamo un protocollo dettagliato e un video tutorial per ricostruire la BBB da iPSC umane e modellare CAA in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
La disfunzione della BBB è una comorbilità e, potenzialmente, una causa o un fattore esacerbante in numerose malattie neurologiche 7,40,41. Tuttavia, è quasi impossibile studiare la biologia molecolare e cellulare alla base della disfunzione e della degradazione della BBB negli esseri umani con malattie neurovascolari. La BBB inducibile (iBBB) presentata in questo protocollo fornisce un sistema in vitro che ricapitol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer’s Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation e Brain Injury Association of America. C.G. è supportato da NIH F31NS130909. La Figura 1A è stata creata con BioRender.com.
Materials
| 6e10 amyloid-β antibody | Biolegend | SIG-39320 | Used at 1:1000 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Activin A | Peprotech | 20-14E | |
| Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies | Invitrogen | Various | Used at 1:1000 |
| Amyloid-beta 40 fibril | AnaSpec | AS-24235 | |
| Amyloid-beta 42 fibril | AnaSpec | AS-20276 | |
| Aquaporin-4 antibody | Invitrogen | PA5-53234 | Used at 1:300 |
| Astrocyte basal media and supplements | ScienCell | 1801 | |
| B-27 serum-free supplement | Gibco | 17504044 | |
| BMP4 | Peprotech | 120-05ET | |
| CHIR99021 | Cyamn Chemical | 13112 | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX medium | Gibco | 10565018 | |
| Doxycycline | Millipore-Sigma | D3072-1ML | |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Fluoromount-G slide mounting medium | VWR | 100502-406 | |
| Forskolin | R&D Systems | 1099/10 | |
| GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement | Gibco | A1413302 | |
| Glass Bottom 48-well Culture Dishes | Mattek Corporation | P48G-1.5-6-F | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Human Endothelial Serum-free medium | Gibco | 11111044 | |
| LDN193189 | Tocris | 6053 | |
| Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| N-2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Millipore-Sigma | S30-100mL | Use serum to match secondary antibody host |
| Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher | 28908 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 100-14B | |
| PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody | R&D Systems | AF385 | Used at 1:500 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010031 | |
| Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody | R&D Systems | AF806 | Used at 1:500 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) | AddGene | Catalog #168805 | |
| S100B antibody | Sigma-Aldrich | S2532-100uL | Used at 1:500 |
| SB43152 | Reprocell | 04-0010 | |
| Thioflavin T | Chem Impex | 22870 | Used at 25uM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250mL | |
| VE-cadherin (CD144) antibody | R&D systems | AF938 | Used at 1:500 |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254/10 | |
| ZO-1 | Invitrogen | MA3-39100-A488 | Dilution = 1:500 |
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