Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo

Bacteriófagos, ou fagos, são vírus que infectam e matam bactérias com especificidade em nível de espécie e cepa¹. Os fagos desempenham papéis importantes dentro de comunidades bacterianas complexas, como a microbiota intestinal, onde têm sido implicados na regulação da dinâmica populacional e na condução da aptidão bacteriana². Ao longo da última década, tem havido um interesse renovado na pesquisa de fagos devido ao aumento de patógenos resistentes a antimicrobianos3 e ao potencial da fagoterapia como estratégia alternativa de tratamento. Nos últimos anos, coquetéis de fagos líticos têm sido utilizados por via intravenosa com algum sucesso em infecções sépticas bacterianas graves e resistentes a antibióticos em humanos ^3,4. A fagoterapia oral também tem sido proposta como uma alternativa potencial aos antibióticos para tratar infecções intestinais e inflamação. Além disso, fagos têm sido implicados no sucesso dos transplantes de filtrado fecal (FFT), que são preparações da microbiota fecal que foram filtradas para remover bactérias, no tratamento da infecção recorrente por Clostridioides difficile (rCDI)^5,6, distúrbios inflamatórios intestinais (DII)^7,8 e enterocolite necrosante em suínos ^prematuros9. Diante desses resultados, é importante considerar interações tanto entre fagos e a microbiota intestinal, quanto entre fagos e mamíferos hospedeiros, pois a adição de novos fagos a uma comunidade preexistente pode ter efeitos indiretos sobre a comunidade como um todo, e não apenas sobre suas bactérias-alvo ^2,10.

O estudo das interações dos fagos com suas bactérias-alvo in vitro tem se mostrado útil para a compreensão dos mecanismos e impactos das interações entre fagos e bactérias no intestino. Nesse contexto, demonstrou-se que fagos T4 específicos de Escherichia coli da ordem Caudovirales necessitam de domínios semelhantes a imunoglobulinas (Ig) localizados dentro de proteínas altamente antigênicas do capsídeo externo (Hoc) na superfície do vírion para aderir ao muco intestinal¹¹. Além disso, ensaios transwell mostraram que fagos T4 são capazes de interagir com culturas de células epiteliais e translocar através das camadas celulares por macropinocitose^12,13. Estes resultados suportam a hipótese de que os fagos podem interagir com seus hospedeiros metazoários, mesmo sendo incapazes de infectar células eucarióticas. Esses modelos, embora úteis, carecem de toda a gama de interações complexas que ocorrem em um ecossistema intestinal que são necessárias para uma exploração abrangente da interação tripartite entre fagos, bactérias e o hospedeiro metazoário.

Modelos de camundongos são uma ferramenta importante para a investigação de fagos em ambientes complexos. Uma aplicação desejável da administração de fagos é como uma estratégia alternativa para tratar infecções resistentes a antimicrobianos ou patobiontes associados a doenças inflamatórias crônicas, incluindo DII. No entanto, a literatura emergente sugere que o comportamento dos fagos in vitro não representa completamente as funções in vivo. Buttimer et ^al.14 demonstraram que um coquetel de fagos foi capaz de esgotar as bactérias-alvo em um consórcio simplificado de microbiota humana in vitro, mas não pôde ser replicado in vivo em camundongos gnotobióticos colonizados com o mesmo consórcio bactéria-fago. Além disso, em um microbioma convencional de camundongos, o fago T7 levou à depleção seletiva de suas bactérias intestinais alvo, embora a recuperação gradual tenha sido observada ao longo do tempo, indicando resistência evoluída¹⁵. Outros estudos demonstraram a coexistência de fagos administrados por via oral e suas cepas bacterianas alvo in vivo ^2,16. De fato, além da coexistência de fago/bactéria, a administração de fagos levou a mudanças generalizadas na composição e função geral da comunidade da microbiota ^2,16. Isso é relevante em situações de doença, pois vários estudos encontraram associações entre o aumento da abundância relativa de caudovirais e DII ^7,8,17 que foram independentes de mudanças na abundância bacteriana⁷. Ainda não se sabe se isso é um fator determinante ou consequência da patogênese da doença.

O foco histórico da investigação de fagos tem sido em torno da relação entre um fago e sua bactéria-alvo. No entanto, também é importante considerar potenciais interações entre o fago e a mucosa, o epitélio e o sistema imune do hospedeiro metazoário. Todas essas interações desempenham um papel importante na resposta global à infecção intestinal por fago. Para demonstrar isso, fagos têm sido estudados utilizando camundongos germ-free (GF) para elucidar seu impacto no sistema imune sem interferência da microbiota⁸. Nesse sistema, os ácidos nucléicos dos fagos foram detectados por receptores do tipo Toll (TLRs) localizados dentro de endossomos de células imunes fagocíticas (macrófagos e células dendríticas). Isso ativou a sinalização a jusante e estimulou a produção dependente de células T de interferon (IFN)-^{γ 8} ou IFNs tipo I¹⁸. Além disso, Fluckiger et ^al.19 implicaram células T CD8⁺ de memória no reconhecimento de antígenos codificados por fagos (prófagos), o que resultou em reatividade cruzada de células T com antígenos tumorais, resultando em redução da carga tumoral. Finalmente, a produção de anticorpos fago-específicos foi documentada em estudos em camundongos onde fagos foram entregues a modelos animais de forma contínua através da água potável ^8,20, ou por gavagem oral repetida ao longo de vários meses²⁰, demonstrando a capacidade das proteínas dos fagos em promover respostas imunes humais. Embora esses modos de inoculação de fagos permitam o priming ótimo e contínuo do sistema imunológico, eles podem não representar as interações naturais entre fagos e o ambiente intestinal, nem a cinética da terapia fagológica aplicada por via oral. Até o momento, um número limitado de estudos examinou as interações do fago com uma única espécie bacteriana em modelos de camundongos monocolonizados²¹. No entanto, camundongos monocolonizados mostraram-se críticos para decifrar os efeitos micróbio-específicos de espécies individuais sobre o trato gastrointestinal (GI) e o desenvolvimento imunológico 22,23,24, e ainda podem ser úteis na compreensão das interações tripartites entre fagos, suas bactérias-alvo e o hospedeiro metazoário.

De forma empolgante, ainda há muito a aprender sobre as interações entre fagos intestinais e bactérias comensais intestinais, bem como as interações que ocorrem entre o hospedeiro metazoário e os fagos que residem nele. Este protocolo fornece um conjunto de procedimentos para estudar o fago isolado de T4 e sua contraparte bacteriana, E. coli (K-12, BW25113), usando um modelo gnotobiótico em camundongos. Esses procedimentos padronizados também fornecem uma base para otimizar outras díades de fago/bactéria, adaptando os parâmetros de crescimento aos pares de interesse. Os métodos aqui descritos descrevem: (1) Preparação de fagos T4 e lisados veiculares para gavagem oral de camundongos; (2) Administração oral de fago T4 a camundongos monocolonizados de E. coli gnotobióticos; (3) Monitoramento dos níveis de fagos T4 em fezes e tecidos de camundongos ao longo do tempo.

Para os resultados representativos aqui apresentados, lisados purificados de fagos T4 foram propagados a partir de estoques de bancos de fagos mantidos pelo Rohwer Lab. O método Phage-on-Tap para propagação de fago T4 foi adaptado²⁵, conforme referenciado neste protocolo. O método produz altos títulos e baixos estoques de fago com endotoxina em três dias. Utilizando essa abordagem, 10 mL de ≥ 10¹⁰ unidades formadoras de placa (pfu)/mL de fago T4 com < 0,5 unidades de endotoxina (EU)/mL foram rotineiramente coletados. Os níveis recomendados de endotoxinas para administração oral ou intravenosa em ratinhos são ≤ 20 EU/ml e ≤ 5 EU/kg/h (ou 0,1 EU administrados durante 1 h para um ratinho de 20 g), respetivamente, tornando este um método adequado de preparação de fagos para inoculação in vivo . Todos os estoques de fago foram armazenados a 4 °C em tampão fagogênico salino magnésio (SM) (receita fornecida na etapa 1.1.5.1). E. coli foi cultivada em meio LB. Para vários pares de fagos-bactérias, diversos meios de cultura e condições de crescimento podem ser adaptados a partir deste protocolo. Os fagos também podem ser obtidos do ambiente, tais como águas residuais, água marinha, solo e conteúdo intestinal, e podem ser isolados e purificados conforme Sambrook e Russell²⁶ antes da preparação, usando as condições apropriadas de crescimento e propagação para cada par fago-hospedeiro de interesse²⁵. Alternativamente, os fagos podem ser obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) ou de bancos de fagos.