Взаимодействие бактериофага Т4 и кишечной палочки в кишечнике мышей: прототипная модель для изучения динамики бактериофагов хозяина in vivo

Бактериофаги, или фаги, — это вирусы, которые инфицируют и убивают бактерии со специфичностью на уровне видов и штаммов¹. Фаги играют важную роль в сложных бактериальных сообществах, таких как микробиота кишечника, где они участвуют в регулировании динамики популяций и обеспечении приспособленности бактерий². В течение последнего десятилетия возродился интерес к исследованиям фагов в связи с ростом числа устойчивых к противомикробным^{препаратам} патогенов3 и потенциалом фаговой терапии в качестве альтернативной стратегии лечения. В последние годы коктейли с литическими фагами используются внутривенно с некоторым успехом при серьезных, устойчивых к антибиотикам бактериальных септических инфекциях у людей ^3,4. Пероральная фаговая терапия также была предложена в качестве потенциальной альтернативы антибиотикам для лечения кишечных инфекций и воспалений. Кроме того, фаги участвуют в успешном проведении трансплантации фекального фильтрата (БПФ), представляющего собой препараты фекальной микробиоты, фильтруемые для удаления бактерий, при лечении рецидивирующей инфекции Clostridioides difficile (rCDI)^5,6, воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК)^7,8 и некротизирующего энтероколита у недоношенных свиней⁹. Учитывая эти результаты, важно учитывать взаимодействие как между фагами и микробиотой кишечника, так и между фагами и хозяином млекопитающих, поскольку добавление новых фагов в уже существующее сообщество может иметь косвенное влияние на сообщество в целом, а не только на его целевые^{бактерии 2,10}.

Изучение взаимодействия фагов с бактериями-мишенями in vitro оказалось полезным для понимания механизмов и последствий взаимодействия фагов и бактерий в кишечнике. В этих условиях было показано, что специфическим Т4-фагам Escherichia coli порядка Caudovirales требуются иммуноглобулиновые (Ig)-подобные домены, расположенные в высокоантигенных белках внешнего капсида (Hoc) на поверхности вириона, для прилипания к кишечной слизи¹¹. Кроме того, трансвелл-анализы показали, что фаги Т4 способны взаимодействовать с эпителиальными клеточными культурами и транслоцироваться через клеточные слои путем макропиноцитоза^12,13. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что фаги могут взаимодействовать со своим многоклеточным хозяином, даже если они не способны инфицировать эукариотические клетки. Эти модели, хотя и полезны, не учитывают весь спектр сложных взаимодействий, происходящих в экосистеме кишечника, которые необходимы для всестороннего исследования трехстороннего взаимодействия между фагами, бактериями и многоклеточным хозяином.

Мышиные модели являются важным инструментом для исследования фагов в сложных средах. Желательным применением фагового введения является альтернативная стратегия лечения инфекций, устойчивых к противомикробным препаратам, или патологий, связанных с хроническими воспалительными заболеваниями, включая ВЗК. Тем не менее, в новой литературе высказывается предположение, что поведение фагов in vitro не в полной мере отражает функции in vivo. Buttimer et ^al.14 продемонстрировали, что фаговый коктейль способен истощать целевые бактерии в упрощенном консорциуме микробиоты человека in vitro, но не может быть воспроизведен in vivo на гнотобиотических мышах, колонизированных тем же бактериально-фаговым консорциумом. Кроме того, в обычном микробиоме мышей фаг Т7 приводил к селективному истощению кишечных бактерий-мишеней, хотя со временем наблюдалось постепенное восстановление, что свидетельствует об эволюционировавшей резистентности¹⁵. Другие исследования продемонстрировали сосуществование перорально вводимых фагов и их штаммов-мишеней бактерий in vivo ^2,16. Действительно, помимо сосуществования фагов и бактерий, введение фагов привело к широкомасштабным изменениям в общем составе и функционировании сообщества микробиоты ^2,16. Это актуально в условиях заболевания, поскольку в нескольких исследованиях была обнаружена связь между повышенным относительным количеством Caudovirales и ВЗК ^7,8,17, которые не зависели от изменений в бактериальной численности⁷. Остается неизвестным, является ли это драйвером или следствием патогенеза заболевания.

Исторически в центре внимания фаговых исследований были отношения между фагом и его бактерией-мишенью. Однако также важно учитывать потенциальные взаимодействия между фагом и слизистой оболочкой, эпителием и иммунной системой многоклеточного хозяина. Все эти взаимодействия играют важную роль в общей реакции на кишечную фаговую инфекцию. Чтобы продемонстрировать это, фаги были изучены на безмикробных мышах (GF), чтобы выяснить их влияние на иммунную систему без вмешательства микробиоты⁸. В этой системе фаговые нуклеиновые кислоты детектировались толл-подобными рецепторами (TLR), расположенными в эндосомах фагоцитарных иммунных клеток (макрофагов и дендритных клеток). Это активировало нисходящую передачу сигналов и стимулировало Т-клеточную зависимую продукцию интерферона (ИФН)-γ⁸ или ИФН I типа¹⁸. Кроме того, Fluckiger et ^al.19 вовлекали CD8⁺ Т-клетки памяти в распознавание фаг-кодируемых (профаговых) антигенов, что приводило к перекрестной реактивности Т-клеток с опухолевыми антигенами, что приводило к снижению опухолевой нагрузки. Наконец, выработка фагоспецифических антител была задокументирована в исследованиях на мышах, где фаги доставлялись животным моделям непрерывно через питьевую воду ^8,20 или путем многократного перорального зондирования в течение нескольких^{месяцев20}, демонстрируя способность фаговых белков стимулировать гуморальный иммунный ответ. Несмотря на то, что эти способы фаговой инокуляции позволяют обеспечить оптимальную и непрерывную подготовку иммунной системы, они могут не отражать естественное взаимодействие между фагами и кишечной средой, а также кинетику пероральной фаговой терапии. До сих пор в ограниченном числе исследований изучалось взаимодействие фага с одним видом бактерий в моноколонизированных мышиных моделях²¹. Тем не менее, моноколонизированные мыши оказались критически важными в расшифровке микробно-специфических эффектов отдельных видов на желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) и иммунное развитие 22,23,24, и они еще могут оказаться полезными для понимания трехсторонних взаимодействий между фагами, их бактериями-мишенями и многоклеточным хозяином.

Интересно, что еще многое предстоит узнать о взаимодействии между кишечным фагом и кишечными комменсальными бактериями, а также о взаимодействиях, которые происходят между многоклеточным хозяином и фагами, которые в нем находятся. Этот протокол предусматривает набор процедур для изучения изолированного фага Т4 и его бактериального аналога E. coli (K-12, BW25113) с использованием гнотобиотической мышиной модели. Эти стандартизированные процедуры также обеспечивают основу для оптимизации других диад фаг/бактерия путем адаптации параметров роста к интересующим парам. Методы, описанные здесь, включают: (1) Приготовление фагов Т4 и носителей лизатов для перорального зондирования мышей; (2) Пероральное введение фага Т4 моноколонизированным гнотобиотическим мышам E. coli ; (3) Мониторинг уровня фагов Т4 в фекалиях и тканях мышей с течением времени.

Для получения репрезентативных результатов, представленных здесь, очищенные лизаты фагов Т4 размножали из запасов фаговых банков, поддерживаемых лабораторией Рохвера. Метод Phage-on-Tap для размножения фага Т4 был адаптирован²⁵, как указано в этом протоколе. Метод позволяет получить высокие титры и низкий уровень эндотоксинов в течение трех дней. Используя этот подход, обычно собирали 10 мл ≥^{10 10} бляшеобразующих единиц (БОЕ)/мл фага Т4 с < 0,5 единиц эндотоксина (ЕС)/мл. Рекомендуемые уровни эндотоксина для перорального или внутривенного введения мышам составляют ≤ 20 ЕС/мл и ≤ 5 ЕЗЕ/кг/ч (или 0,1 ЕИ, вводимых в течение 1 ч для мышей весом 20 г), соответственно, что делает этот метод подходящим методом подготовки фагов для инокуляции in vivo . Все запасы фагов хранили при температуре 4 °C в фаговом буфере на основе солевого магния (SM) (рецепт приведен на этапе 1.1.5.1). Кишечную палочку культивировали в средах LB. Для различных пар фаг-бактерии этот протокол может адаптировать различные питательные среды и условия роста. Фаги также могут быть получены из окружающей среды, такой как сточные воды, морская вода, почва и содержимое кишечника, и могут быть изолированы и очищены в соответствии с Сэмбруком и Расселом²⁶ перед приготовлением, используя соответствующие условия роста и размножения для каждой интересующей пары фаг-хозяин²⁵. В качестве альтернативы фаги могут быть получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) или из фаговых банков.