Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Bakteriyofajlar veya fajlar, tür ve suş düzeyinde özgüllük¹ ile bakterileri enfekte eden ve öldüren virüslerdir. Fajlar, popülasyon dinamiklerini düzenlemede ve bakteriyel uygunluğu yönlendirmede rol oynadıkları bağırsak mikrobiyotası gibi karmaşık bakteri topluluklarında önemli roller oynarlar². Son on yıl boyunca, antimikrobiyal dirençli patojenlerin³ yükselişi ve alternatif bir tedavi stratejisi olarak faj tedavisinin potansiyeli nedeniyle faj araştırmalarına olan ilgi yeniden artmıştır. Son yıllarda, litik faj kokteylleri, insanlarda ciddi, antibiyotiğe dirençli bakteriyel septik enfeksiyonlarda bir miktar başarı ile intravenöz olarak kullanılmıştır ^3,4. Oral faj tedavisi, bağırsak enfeksiyonlarını ve iltihabı tedavi etmek için antibiyotiklere potansiyel bir alternatif olarak da önerilmiştir. Ayrıca, fajlar, tekrarlayan Clostridioides difficile enfeksiyonu (rCDI)^5,6, inflamatuar bağırsak bozuklukları (IBD)^7,8 ve erken doğmuş domuzlarda nekrotizan enterokolit tedavisinde bakterileri uzaklaştırmak için filtrelenmiş dışkı mikrobiyota preparatları olan dışkı süzüntü nakillerinin⁽FFT) başarısında rol oynamıştır. Bu sonuçlar göz önüne alındığında, hem fajlar ve bağırsak mikrobiyotası hem de fajlar ve memeli konakçı arasındaki etkileşimleri dikkate almak önemlidir, çünkü önceden var olan bir topluluğa yeni fajların eklenmesi, yalnızca hedef bakteriler üzerinde değil, bir bütün olarak topluluk üzerinde dolaylı etkilere sahip olabilir ^2,10.

Fajların hedef bakterilerle etkileşimlerinin in vitro olarak incelenmesinin, bağırsaktaki faj ve bakteri etkileşimlerinin mekanizmalarını ve etkilerini anlamak için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu ortamda, Caudovirales takımının Escherichia coli’ye özgü T4 fajlarının, bağırsak mukusuna^yapışmak için virion yüzeyindeki yüksek antijenik dış kapsid (Hoc) proteinleri içinde yer alan immünoglobulin (Ig) benzeri alanlara ihtiyaç duyduğu gösterilmiştir 11. Ek olarak, transwell deneyleri, T4 fajlarının epitel hücre kültürleri ile etkileşime girebildiğini ve makropinositoz^12,13 ile hücre katmanları boyunca yer değiştirebildiğini göstermiştir. Bu sonuçlar, fajların ökaryotik hücreleri enfekte edemeseler bile metazoan konakçılarıyla etkileşime girebilecekleri hipotezini desteklemektedir. Bu modeller, yararlı olmakla birlikte, fajlar, bakteriler ve metazoan konakçı arasındaki üçlü etkileşimin kapsamlı bir şekilde araştırılması için gerekli olan bir bağırsak ekosisteminde meydana gelen tüm karmaşık etkileşimlerden yoksundur.

Fare modelleri, karmaşık ortamlarda fajları araştırmak için önemli bir araçtır. Faj uygulamasının arzu edilen bir uygulaması, IBD dahil olmak üzere kronik enflamatuar hastalıklarla ilişkili antimikrobiyal dirençli enfeksiyonları veya patobiyonları tedavi etmek için alternatif bir stratejidir. Bununla birlikte, ortaya çıkan literatür, in vitro faj davranışının in vivo fonksiyonları tam olarak temsil etmediğini göstermektedir. Buttimer ve ^ark.14, bir faj kokteylinin, basitleştirilmiş bir insan mikrobiyota konsorsiyumunda hedeflenen bakterileri in vitro olarak tüketebildiğini, ancak aynı bakteri-faj konsorsiyumu ile kolonize edilen gnotobiyotik farelerde in vivo olarak çoğaltılamadığını gösterdi. Ayrıca, geleneksel bir fare mikrobiyomunda, T7 fajı, hedef bağırsak bakterilerinin seçici olarak tükenmesine yol açtı, ancak zaman içinde kademeli iyileşme gözlendi, bu da gelişmiş direncin^{göstergesi 15}. Diğer çalışmalar, oral yoldan uygulanan fajların ve hedef bakteri suşlarının in vivo ^2,16 bir arada bulunduğunu göstermiştir. Gerçekten de, faj/bakteri birlikteliğinin ötesinde, faj uygulaması genel mikrobiyota topluluğu bileşiminde ve işlevinde yaygın değişikliklere yol açmıştır ^2,16. Bu, hastalık ortamlarında önemlidir, çünkü birkaç çalışma, Caudovirales’in nispi bolluğunun artması ile IBD ^7,8,17 arasında bakteri bolluğundaki değişikliklerden bağımsız olarak ilişkiler bulmuştur⁷. Bunun hastalık patogenezinin bir itici gücü mü yoksa bir sonucu mu olduğu bilinmemektedir.

Faj araştırmasının tarihsel odak noktası, bir faj ile hedef bakteri arasındaki ilişki etrafında olmuştur. Bununla birlikte, faj ile metazoan konağın mukozası, epiteli ve bağışıklık sistemi arasındaki potansiyel etkileşimleri dikkate almak da önemlidir. Bu etkileşimlerin tümü, bağırsak faj enfeksiyonuna verilen genel yanıtta önemli bir rol oynar. Bunu göstermek için, mikrobiyota^8’in müdahalesi olmadan bağışıklık sistemi üzerindeki etkilerini aydınlatmak için mikropsuz (GF) fareler kullanılarak fajlar incelenmiştir. Bu sistemde, faj nükleik asitleri, fagositik immün hücrelerin (makrofajlar ve dendritik hücreler) endozomları içinde bulunan Toll benzeri reseptörler (TLR’ler) tarafından tespit edildi. Bu, aşağı akış sinyalini aktive etti ve T hücresine bağlı interferon (IFN)-γ⁸ veya tip I IFN’ler¹⁸ üretimini uyardı. Ayrıca, Fluckiger ve ^ark.19, faj kodlu (kehanet) antijenlerin tanınmasında bellek CD8⁺ T hücrelerini kullandılar, bu da tümör antijenleri ile T hücresi çapraz reaktivitesi ile sonuçlandı ve bu da tümör yükünün azalmasına neden oldu. Son olarak, fajlara özgü antikor üretimi, fajların hayvan modellerine içme suyu ^8,20 yoluyla sürekli olarak verildiği^veya birkaç ay boyunca tekrarlanan oral gavaj yoluyla²⁰ faj proteinlerinin humoral bağışıklık tepkilerini destekleme kapasitesini gösterdiği fare çalışmalarında belgelenmiştir. Bu faj aşılama modları, bağışıklık sisteminin optimal ve sürekli olarak hazırlanmasına izin verse de, fajlar ve bağırsak ortamı arasında doğal olarak meydana gelen etkileşimleri veya oral yoldan uygulanan faj tedavisinin kinetiğini temsil etmeyebilirler. Şimdiye kadar, sınırlı sayıda çalışma, monokolonize fare modellerinde fajın tek bir bakteri türüyle etkileşimlerini incelemiştir²¹. Bununla birlikte, monokolonize fareler, bireysel türlerin gastrointestinal (GI) sistem ve bağışıklık gelişimi 22,23,24 üzerindeki mikroplara özgü etkilerinin deşifre edilmesinde kritik olduğunu kanıtlamıştır ve fajlar, hedef bakterileri ve metazoan konakçı arasındaki üçlü etkileşimleri anlamada yararlı olabilirler.

Heyecan verici bir şekilde, bağırsak fajı ve bağırsak kommensal bakterileri arasındaki etkileşimlerin yanı sıra metazoan konakçı ile içinde bulunan fajlar arasında meydana gelen etkileşimler hakkında öğrenilecek çok şey var. Bu protokol, bir gnotobiyotik fare modeli kullanarak izole edilmiş T4 fajını ve bakteriyel muadili E. coli’yi (K-12, BW25113) incelemek için bir dizi prosedür sağlar. Bu standartlaştırılmış prosedürler ayrıca, büyüme parametrelerini ilgilenilen çiftlere uyarlayarak diğer faj/bakteri çiftlerini optimize etmek için bir temel sağlar. Burada açıklanan yöntemler şunları özetlemektedir: (1) Farelerin oral gavajı için T4 faj ve araç lizatlarının hazırlanması; (2) T4 fajının E. coli monokolonize gnotobiyotik farelere oral yoldan verilmesi; (3) Fare dışkısında ve dokularında T4 faj seviyelerinin zaman içinde izlenmesi.

Burada sunulan temsili sonuçlar için, saflaştırılmış T4 faj lizatları, Rohwer Laboratuvarı tarafından tutulan faj bankası stoklarından çoğaltıldı. T4 fajını yaymak için Phage-on-Tap yöntemi, bu protokolde atıfta bulunulduğu gibi^25’e uyarlanmıştır. Yöntem, üç gün içinde yüksek titre, endotoksin düşük faj stokları verir. Bu yaklaşım kullanılarak, rutin olarak 10 mL ≥^{10 10} plak oluşturan birim (pfu)/mL < 0.5 endotoksin birimi (EU)/mL T4 faj toplandı. Farelere oral veya intravenöz uygulama için önerilen endotoksin seviyeleri sırasıyla ≤ 20 EU/mL ve ≤ 5 EU/kg/s'dir (veya 20 g'lık bir fare için 1 saat boyunca uygulanan 0.1 EU), bu da bunu in vivo aşılama için uygun bir faj hazırlama yöntemi haline getirir. Tüm faj stokları 4 °C’de salin magnezyum (SM) faj tamponunda saklandı (tarif adım 1.1.5.1’de verilmiştir). E. coli , LB ortamında yetiştirildi. Çeşitli faj-bakteri çiftleri için, çeşitli kültür ortamları ve büyüme koşulları bu protokolden uyarlanabilir. Fajlar ayrıca atık su, deniz suyu, toprak ve bağırsak içeriği gibi çevreden de elde edilebilir ve ilgilenilen her bir faj-konakçı çifti için uygun büyüme ve yayılma koşulları kullanılarak hazırlanmadan önce Sambrook ve Russell^26’ya göre izole edilebilir ve saflaştırılabilir²⁵. Alternatif olarak, fajlar ticari kaynaklardan (bkz . Malzeme Tablosu) veya faj bankalarından elde edilebilir.