マウス腸におけるT4バクテリオファージと 大腸菌 の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をIn vivoで研究するためのプロトタイプモデル

バクテリオファージ(ファージ)は、細菌に感染して殺すウイルスで、種と菌株レベルの特^{異性があります}1。ファージは、腸内細菌叢などの複雑な細菌群集で重要な役割を果たしており、個体群動態の調節や細菌の適応度の向上に関与しています²。過去10年間、抗菌薬耐性病原体^の台頭3と、代替治療戦略としてのファージ療法の可能性により、ファージ研究への関心が再燃しています。近年、溶解性ファージカクテルは静脈内投与され、ヒトの重篤な抗生物質耐性細菌性敗血症感染症に一定の成功を収めています^3,4。経口ファージ療法は、腸の感染症や炎症を治療するための抗生物質の潜在的な代替手段としても提案されています。さらに、ファージは、早産ブタの再発性クロストリジオイデス・ディフィシル感染症(rCDI)^5,6、炎症性腸疾患(IBD)^7,8、壊死性腸炎の治療において、細菌を除去するためにろ過された糞便微生物叢製剤である糞便濾液移植(FFT)の成功に関与しています⁹.これらの結果を考えると、既存のコミュニティに新規ファージを追加すると、標的細菌だけでなくコミュニティ全体に間接的な影響を与える可能性があるため、ファージと腸内細菌叢、およびファージと哺乳類宿主の両方との相互作用を考慮することが重要です^2,10。

in vitroでのファージと標的細菌との相互作用の研究は、腸内におけるファージと細菌の相互作用のメカニズムと影響を理解するのに役立つことが証明されています。この設定では、カウドビラール目の大腸菌特異的T4ファージが腸粘液に付着するために、ビリオン表面の高抗原外カプシド(Hoc)タンパク質内に位置する免疫グロブリン(Ig)様ドメインを必要とすることが示されている¹¹。さらに、トランズウェルアッセイは、T4ファージが上皮細胞培養と相互作用し、マクロピノサイトーシスによって細胞層を通過できることが示されています^12,13。これらの結果は、ファージが真核細胞に感染できないにもかかわらず、後生動物の宿主と相互作用できるという仮説を支持しています。これらのモデルは有用ではあるが、ファージ、バクテリア、および後生動物の宿主間の三者間相互作用を包括的に調査するために必要な、腸内生態系で発生する複雑な相互作用の全範囲を欠いている。

マウスモデルは、複雑な環境下でファージを調査するための重要なツールです。ファージ投与の望ましい適用は、IBDを含む慢性炎症性疾患に関連する抗菌薬耐性感染症または病原菌を治療するための代替戦略としてである。しかし、新しい文献は、in vitroでのファージの挙動がin vivoの機能を完全には表していないことを示唆しています。Buttimerら¹⁴は、ファージカクテルは、簡略化されたヒト微生物叢コンソーシアムでは標的細菌を枯渇させることができたが、同じ細菌-ファージコンソーシアムでコロニーを形成したgnotobioticマウスではin vivoで再現できなかったことを実証した。さらに、従来のマウスマイクロバイオームでは、T7ファージは標的腸内細菌の選択的枯渇を引き起こしたが、時間の経過とともに緩やかな回復が観察され、耐性が進化したことを示している¹⁵。他の研究では、経口投与されたファージとその標的細菌株がin vivoで共存していることが実証されています^2,16。実際、ファージとバクテリアの共存を超えて、ファージ投与は全体的な微生物叢群集の構成と機能に広範な変化をもたらしました^2,16。いくつかの研究で、細菌量の変化とは無関係に、カウドウイルス類の相対存在量の増加とIBD ^7,8,17との関連が明らかになっているため、これは疾患状況に関連して^{います7。}これが病気の病因の要因なのか結果なのかは不明のままです。

ファージ調査の歴史的焦点は、ファージとその標的細菌との関係に関するものでした。ただし、ファージと後生動物の粘膜、上皮、および免疫系との間の潜在的な相互作用を考慮することも重要です。これらの相互作用はすべて、腸管ファージ感染に対する全体的な反応において重要な役割を果たします。これを実証するために、ファージは微生物叢8による干渉なしで免疫系への影響を解明するために無菌(GF)マウスを使用して研究^{されています。}このシステムでは、ファージ核酸は、食作用免疫細胞(マクロファージおよび樹状細胞)のエンドソーム内に位置するToll様受容体(TLR)によって検出されました。これにより、下流のシグナル伝達が活性化され、インターフェロン(IFN)-γ 8またはI型^IFN18のT細胞依存性産生が刺激された。さらに、Fluckigerらは、ファージコード(プロファージ)抗原の認識にメモリーCD8⁺ T^{細胞を関与}させ、その結果、T細胞が腫瘍抗原と交差反応し、腫瘍負荷が軽減されたことを示しました。最後に、ファージ特異的抗体産生は、ファージが^{飲料水を介して}継続的に動物モデルに送達されたマウス研究で文書化されており^8,20、または数ヶ月にわたって繰り返し経口強制経口投与によって²⁰、ファージタンパク質が体液性免疫応答を促進する能力を実証しています。ファージ接種のこれらのモードは、免疫系の最適かつ継続的なプライミングを可能にしますが、ファージと腸環境との間の自然に発生する相互作用や、経口適用されたファージ療法の動態を表していない可能性があります。これまでのところ、限られた数の研究が、単一コロニー化されたマウスモデルにおけるファージと単一の細菌種との相互作用を調べた²¹。しかし、単コロニー化されたマウスは、消化管(GI)と免疫発達に対する個々の種の微生物特異的な影響を解読する上で重要であることが証明され22,23,24、ファージ、標的細菌、および後生動物の宿主の間の三者間相互作用を理解するのに有用であることが証明される可能性があります。

興味深いことに、腸内ファージと腸内共生細菌の相互作用、および後生動物の宿主とその中に存在するファージとの間で発生する相互作用については、まだ学ぶべきことがたくさんあります。このプロトコルはgnotobioticマウス モデルを使用して隔離されたT4バクテリオファージおよび細菌の同等、 エシェリヒ属大腸菌 (K-12、BW25113)を調査する一組のプロシージャを提供する。また、これらの標準化された手順は、増殖パラメータを目的のペアに適合させることにより、他のファージ/バクテリアダイアドを最適化するための基盤を提供します。ここで説明する方法は、(1)マウスの経口強制経口投与のためのT4ファージおよびビヒクルライセートの調製;(2) 大腸菌 モノコロニー化gnotobioticマウスへのT4ファージの経口投与;(3)マウスの糞便および組織のT4ファージレベルを経時的に監視する。

ここで紹介した代表的な結果として、精製したT4ファージライセートは、Rohwer Labが管理するファージバンクストックから増殖させました。T4ファージを伝播させるためのファージ・オン・タップ法は、このプロトコルで参照されているように、^{適合させた25}。この方法では、3日以内に高力価のエンドトキシン低ファージストックが得られます。このアプローチを利用して、10 mLの≥ 10¹⁰プラーク形成単位(pfu)/mLのT4ファージと<0.5エンドトキシン単位(EU)/mLを日常的に収集しました。マウスへの経口投与または静脈内投与の推奨エンドトキシンレベルは、それぞれ≤ 20 EU/mLおよび≤ 5 EU/kg/h(または20 gマウスの場合は0.1 EU)であり、in vivo 接種に適したファージ調製法です。すべてのファージストックを生理食塩水マグネシウム(SM)ファージバッファー(ステップ1.1.5.1で提供)に4°Cで保存しました。 大腸菌 はLB培地で培養した。さまざまなバクテリオファージとバクテリアのペアについて、多様な培地と成長条件をこのプロトコルから適合させることができます。ファージはまた、廃水、海水、土壌および腸内容物などの環境から供給することができ、SambrookおよびRussell²⁶に従って、対象の各ファージ−宿主対²⁵に対する適切な増殖および増殖条件を用いて調製前に単離および精製することができる。あるいは、ファージは、市販の供給源( 材料表を参照)またはファージバンクから得ることができる。