Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

Los bacteriófagos, o fagos, son virus que infectan y matan bacterias con especificidad a nivel de especie y cepa^. Los fagos desempeñan un papel importante dentro de comunidades bacterianas complejas, como la microbiota intestinal, donde se han implicado en la regulación de la dinámica de la población y en la mejora de la aptitud bacteriana². A lo largo de la última década, ha habido un renovado interés en la investigación de fagos debido al aumento de patógenos resistentes a los antimicrobianos³ y el potencial de la terapia con fagos como estrategia de tratamiento alternativa. En los últimos años, los cócteles de fagos líticos se han utilizado por vía intravenosa con cierto éxito en infecciones sépticas bacterianas graves y resistentes a los antibióticos en humanos ^3,4. La terapia oral con fagos también se ha propuesto como una alternativa potencial a los antibióticos para tratar las infecciones intestinales y la inflamación. Además, los fagos han sido implicados en el éxito de los trasplantes de filtrado fecal (FFT), que son preparaciones de microbiota fecal que se han filtrado para eliminar bacterias, en el tratamiento de la infección recurrente por Clostridioides difficile (rCDI)^5,6, los trastornos inflamatorios intestinales (EII)^7,8 y la enterocolitis necrotizante en cerdos prematuros⁹. Teniendo en cuenta estos resultados, es importante tener en cuenta las interacciones tanto entre los fagos y la microbiota intestinal, como entre los fagos y el huésped mamífero, ya que la adición de nuevos fagos a una comunidad preexistente puede tener efectos indirectos en la comunidad en su conjunto, y no solo en sus bacterias diana ^2,10.

El estudio in vitro de las interacciones de los fagos con sus bacterias diana ha demostrado ser útil para comprender los mecanismos y los impactos de las interacciones de los fagos y las bacterias en el intestino. En este contexto, se ha demostrado que los fagos T4 específicos de Escherichia coli del orden Caudovirales requieren dominios similares a inmunoglobulinas (Ig) ubicados dentro de proteínas de la cápside externa (Hoc) altamente antigénicas en la superficie del virión para adherirse al moco intestinal¹¹. Además, los ensayos de transwell han demostrado que los fagos T4 son capaces de interactuar con cultivos celulares epiteliales y translocarse a través de las capas celulares por macropinocitosis^12,13. Estos resultados apoyan la hipótesis de que los fagos pueden interactuar con su huésped metazoario, a pesar de que son incapaces de infectar las células eucariotas. Estos modelos, si bien son útiles, carecen de la gama completa de interacciones complejas que ocurren en un ecosistema intestinal que se requieren para una exploración exhaustiva de la interacción tripartita entre los fagos, las bacterias y el huésped metazoario.

Los modelos de ratón son una herramienta importante para investigar fagos en entornos complejos. Una aplicación deseable de la administración de fagos es como una estrategia alternativa para tratar infecciones resistentes a los antimicrobianos o patógenos asociados con enfermedades inflamatorias crónicas, incluida la EII. Sin embargo, la literatura emergente sugiere que el comportamiento de los fagos in vitro no representa completamente las funciones in vivo. Buttimer et ^al.14 demostraron que un cóctel de fagos era capaz de agotar las bacterias objetivo en un consorcio simplificado de microbiota humana in vitro, pero no podía replicarse in vivo en ratones gnotobióticos colonizados con el mismo consorcio bacteria-fago. Además, en un microbioma de ratón convencional, el fago T7 condujo a un agotamiento selectivo de sus bacterias intestinales objetivo, aunque se observó una recuperación gradual a lo largo del tiempo, lo que indica una resistencia evolucionada¹⁵. Otros estudios han demostrado la coexistencia de fagos administrados por vía oral y sus cepas bacterianas diana in vivo ^2,16. De hecho, más allá de la coexistencia entre fagos y bacterias, la administración de fagos dio lugar a cambios generalizados en la composición y función general de la comunidad de microbiota ^2,16. Esto es relevante en entornos de enfermedad, ya que varios estudios han encontrado asociaciones entre el aumento de la abundancia relativa de caudovirales y la EII ^7,8,17 que fueron independientes de los cambios en la abundancia bacteriana⁷. Se desconoce si esto es un impulsor o una consecuencia de la patogénesis de la enfermedad.

El enfoque histórico de la investigación de fagos ha girado en torno a la relación entre un fago y su bacteria objetivo. Sin embargo, también es importante tener en cuenta las posibles interacciones entre el fago y la mucosa, el epitelio y el sistema inmunitario del huésped metazoario. Todas estas interacciones juegan un papel importante en la respuesta general a la infección por fagos intestinales. Para demostrarlo, se han estudiado los fagos con ratones libres de gérmenes (GF) para dilucidar su impacto en el sistema inmunitario sin interferencia de la microbiota⁸. En este sistema, los ácidos nucleicos de los fagos fueron detectados por receptores tipo Toll (TLR) ubicados dentro de los endosomas de las células inmunes fagocíticas (macrófagos y células dendríticas). Esto activó la señalización descendente y estimuló la producción dependiente de células T de interferón (IFN)-^{γ 8} o IFN tipo I¹⁸. Además, Fluckiger et ^al.19 implicaron a los linfocitos T CD8⁺ de memoria en el reconocimiento de antígenos codificados por fagos (profagos), lo que dio lugar a una reactividad cruzada de los linfocitos T con los antígenos tumorales, lo que resultó en una reducción de la carga tumoral. Por último, la producción de anticuerpos específicos de fagos se ha documentado en estudios con ratones en los que se administraron fagos a modelos animales de forma continua a través del agua de bebida ^8,20, o mediante sonda nasogástrica oral repetida durante varios meses²⁰, lo que demuestra la capacidad de las proteínas de los fagos para promover respuestas inmunitarias humorales. Aunque estos modos de inoculación de fagos permiten un cebado óptimo y continuo del sistema inmunitario, es posible que no representen las interacciones naturales entre los fagos y el entorno intestinal, ni la cinética de la terapia con fagos aplicada por vía oral. Hasta ahora, un número limitado de estudios han examinado las interacciones de los fagos con una sola especie bacteriana en modelos de ratón monocolonizados²¹. Sin embargo, los ratones monocolonizados demostraron ser fundamentales para descifrar los efectos específicos de los microbios de especies individuales en el tracto gastrointestinal (GI) y el desarrollo inmunológico 22,23,24, y aún pueden resultar útiles para comprender las interacciones tripartitas entre los fagos, sus bacterias objetivo y el huésped metazoario.

Curiosamente, todavía hay mucho que aprender sobre las interacciones entre los fagos intestinales y las bacterias comensales intestinales, así como las interacciones que se producen entre el huésped metazoario y los fagos que residen en él. Este protocolo proporciona un conjunto de procedimientos para estudiar el fago T4 aislado y su contraparte bacteriana, E. coli (K-12, BW25113), utilizando un modelo de ratón gnotobiótico. Estos procedimientos estandarizados también proporcionan una base para optimizar otras díadas de fagos/bacterias mediante la adaptación de los parámetros de crecimiento a los pares de interés. Los métodos descritos aquí describen: (1) Preparación de lisados de fagos y vehículos T4 para la sonda nasogástrica oral de ratones; (2) Administración oral de fagos T4 a ratones gnotobióticos monocolonizados por E. coli ; (3) Monitoreo de los niveles de fagos T4 en heces y tejidos de ratón a lo largo del tiempo.

Para los resultados representativos presentados aquí, los lisados de fagos T4 purificados se propagaron a partir de las existencias de bancos de fagos mantenidos por el Laboratorio Rohwer. Se adaptó el método Phage-on-Tap para propagar el fago T4²⁵, como se menciona en este protocolo. El método produce un alto título y bajas reservas de fagos con endotoxinas en tres días. Utilizando este enfoque, se recolectaron rutinariamente 10 ml de ≥^{10 10} unidades formadoras de placa (ufp)/ml de fago T4 con < 0,5 unidades de endotoxinas (UE)/ml. Los niveles de endotoxinas recomendados para la administración oral o intravenosa en ratones son ≤ 20 UE/ml y ≤ 5 UE/kg/h (o 0,1 UE administrados durante 1 h para un ratón de 20 g), respectivamente, lo que lo convierte en un método adecuado de preparación de fagos para la inoculación in vivo . Todas las cepas de fagos se almacenaron a 4 °C en tampón salino de magnesio y magnesio (SM) para fagos (receta proporcionada en el paso 1.1.5.1). E. coli se cultivó en medios LB. Para varios pares de fagos-bacterias, se pueden adaptar diversos medios de cultivo y condiciones de crecimiento a partir de este protocolo. Los fagos también pueden obtenerse del medio ambiente, como las aguas residuales, el agua marina, el suelo y el contenido intestinal, y pueden aislarse y purificarse según Sambrook y Russell²⁶ antes de la preparación utilizando las condiciones de crecimiento y propagación adecuadas para cada par de interés fago-huésped²⁵. Alternativamente, los fagos pueden obtenerse de fuentes comerciales (véase la Tabla de materiales) o de bancos de fagos.