口腔カンジダ症のマウスモデルに対するクルクミノイド媒介抗菌光線力学療法
Summary
このプロトコルは口頭カンジダ症のマウスモデルに抗菌光線力学療法(aPDT)の適用を記述する。aPDTは、クルクミノイドと青色LED光の水溶性混合物を用いて実施した。
Abstract
抗菌光線力学療法(aPDT)は in vitroで広く研究されており、感染症の前臨床動物モデルは、臨床試験前の代替治療の評価に適しています。この研究では、口腔カンジダ症のマウスモデルにおけるaPDTの有効性について説明します。40匹のマウスにプレドニゾロンの皮下注射で免疫抑制し、舌を C.アルビカンス 細胞懸濁液に浸した口腔スワブを用いて接種した。テトラサイクリンは、実験の過程で飲料水 を介して 投与されました。.真菌接種の5日後、マウスを8つのグループに無作為に分配した。未治療の未感染マウスの9番目のグループをネガティブコントロール(n = 5)として含めた。クルクミノイドの混合物の3つの濃度(20 μM、40 μM、および80 μM)を、青色LEDライト(89.2 mW/cm2;~455 nm)および非光(それぞれC+L+およびC+L-グループ)で試験しました。光単独(C-L+)、無治療(C-L-)、および感染のない動物を対照として評価した。データは、ウェルチの分散分析とGames-Howell検定(α = 0.05)を使用して分析されました。口腔カンジダ症は、すべての感染動物で確立され、舌の背部に特徴的な白い斑点または偽膜が存在することによって肉眼的に視覚化されました。病理組織切片では、C-L-群の上皮の角質化層に限定された酵母とフィラメントが大量に存在することが確認され、40μMまたは80μMのクルクミノイドのいずれかでaPDTを受けたマウスから得られた画像では、真菌細胞の存在が視覚的に減少しました。80 μMのクルクミノイドによって媒介されるaPDTは、C-L-群(p = 0.008)と比較して、コロニー数の2.47 log10 の減少を促進しました。他のすべてのグループは、光増感剤(C+L-)または光単独(C-L+)グループを含むコロニーの数に統計的に有意な減少を示さなかった。クルクミノイド媒介aPDTは、マウスの舌からの真菌負荷を減少させた。
Introduction
口腔カンジダ症(OC)は、口腔の主な真菌感染症です。カンジダ属菌の異常増殖が原因です。OCの素因には、内分泌機能障害、広域抗生物質の使用、放射線療法および化学療法、栄養欠乏症、口腔乾燥症(唾液流量の低下)、義歯の使用、衛生状態の悪さ、特に免疫抑制が含まれます1。カンジダ種の中で、カンジダ・アルビカンスは最も一般的で毒性のあるものです。それは人体の共生種として、そして日和見病原体として見られます。C. albicansは、その形態を共生酵母(割胞胞)から病原性フィラメント(菌糸および偽菌糸)に変化させる能力を持っています2。糸状体、特に菌糸は、エンドサイトーシスまたは能動的な浸透によって宿主上皮に侵入し、感染を引き起こす可能性があります3。C.アルビカンスのその他の病原性因子には、脂肪分解酵素、加水分解酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテイナーゼ、カンジダリシンなどの毒素の接着、バイオフィルム形成、分泌などがあります4。
OC治療には、抗真菌剤、特に局所ポリエンとアゾール(ナイスタチンとミコナゾール)の使用が含まれます5。しかし、それらは短期的な有効性を示すにすぎず、再発が頻繁です。さらに、抗真菌剤の過剰使用は、抗真菌剤耐性の発達と広がりの問題を引き起こしました6。そのため、酸素存在下で光増感剤(PS)と適切な波長(PS吸収と同じ波長)の光を組み合わせる抗菌光線力学療法(aPDT)などの代替療法が必要です。PSは細胞に結合または取り込まれ、光によって活性化されると、感作細胞に有毒な活性酸素種(ROS)を産生する7。
aPDTでは、使用される光増感剤(PS)の1つが、ウコン植物(Curcuma longa L.)の根茎から抽出された天然由来の化合物であるクルクミン(CUR)です。クルクミンは、抗炎症作用、抗酸化作用、抗がん作用、抗菌作用など、多くの治療効果を持っています8,9。以前の調査では、CURを利用したaPDTは、宿主の組織に害を及ぼすことなく、口腔カンジダ症のマウスモデルでC.アルビカンスを効果的に減少させることがわかりました10。CURはターメリックから抽出される主なクルクミノイドですが、デメトキシクルクミンやビスデメトキシクルクミンなどの他のポリフェノールもこの植物に含まれています。クルクミノイド媒介aPDTは、カテーテルで増殖した黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに対して抗菌活性を示した11。しかし、私たちの知る限り、C.アルビカンスに対する抗真菌活性は不明のままです。そこで、本研究では、OCのマウスモデルにおいて、C. albicansに対するクルクミノイド塩を介したaPDTを評価した。
Protocol
Representative Results
Discussion
C.アルビカンスは、免疫不全状態、糖尿病、抗生物質の長期使用、および口腔衛生状態の悪い個人の口腔および食道感染症と関連しています1,3。ヒト感染症の研究には、臨床試験を安全かつ正確に設計する前に、in vitroとin vivoの両方の研究が必要です。本研究では、C.アルビカンスによる経口感染症の病因と抗真菌アプロ?…
Acknowledgements
著者らは、FAPESP(サンパウロ研究財団、プロセス番号FAPESP #2013/07276-1(CePID CePOF)および2008/00601-6からの財政的支援に感謝します。また、CURベースの水溶性塩に関する情報を提供してくださったAna Paula Silva博士にも感謝します。
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
- Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15 (2020).
- Sudbery, P. E. Growth of Candida albicans hyphae. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).
- Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface. Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).
- Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
- Quindós, G., et al. Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs. Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).
- Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).
- Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry. Frontiers in Microbiology. 13, 1020995 (2013).
- Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130 (2021).
- Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).
- Dovigo, L. N., et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).
- Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination. Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386 (2022).
- Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).
- Takakura, N., et al. A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush. Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).
- Mima, E. G., et al. Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis. OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).
- Solis, N. V., Filler, S. G. Mouse model of oropharyngeal candidiasis. Nature Protocol. 7 (4), 637-642 (2012).
- Marôco, J. . Análise Estatística com o SPSS Statistics 25. , (2018).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Experimental oral candidiasis in animal models. Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).
- Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. Role of mini-host models in the study of medically important fungi. The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).
- Carmello, J. C., et al. Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo. PLoS One. 11 (6), e0156947 (2016).
- Sakima, V. T., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis. Molecules. 23 (8), 2075 (2018).
- Abe, S., et al. A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).
- Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans. Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).
- Russell, C., Jones, J. H. Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats. Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).
- Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model. OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).
- Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice. Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).
- Hidalgo, K. J. R., et al. Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole. Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140 (2019).
