العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات بوساطة الكركمينويد على نموذج الفئران لداء المبيضات الفموي
Summary
يصف هذا البروتوكول تطبيق العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDT) في نموذج الفئران لداء المبيضات الفموي. تم إجراء aPDT باستخدام خليط قابل للذوبان في الماء من الكركمينويدات وضوء LED الأزرق.
Abstract
تم التحقيق على نطاق واسع في العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDT) في المختبر ، والنماذج الحيوانية قبل السريرية للعدوى مناسبة لتقييم العلاجات البديلة قبل التجارب السريرية. تصف هذه الدراسة فعالية aPDT في نموذج الفئران لداء المبيضات الفموي. تم تثبيط أربعين فأرا بحقن بريدنيزولون تحت الجلد ، وتم تلقيح ألسنتهم باستخدام مسحة فموية غارقة مسبقا في تعليق خلية C. albicans . تم إعطاء التتراسيكلين عن طريق مياه الشرب أثناء التجربة. بعد خمسة أيام من التلقيح الفطري ، تم توزيع الفئران بشكل عشوائي إلى ثماني مجموعات. تم تضمين مجموعة تاسعة من الفئران غير المصابة غير المعالجة كعنصر تحكم سلبي (ن = 5). تم اختبار ثلاثة تركيزات (20 ميكرومتر و 40 ميكرومتر و 80 ميكرومتر) من خليط من الكركمينويدات باستخدام ضوء LED أزرق (89.2 ميغاواط / سم2 ؛ ~ 455 نانومتر) وبدون ضوء (مجموعات C + L + و C + L- ، على التوالي). تم تقييم الضوء وحده (C-L +) ، وعدم العلاج (C-L-) ، غير المصابة بالعدوى كعناصر تحكم. تم تحليل البيانات باستخدام اختبارات ويلش ANOVA و Games-Howell (α = 0.05). تم تأسيس داء المبيضات الفموي في جميع المصابة وتصوره مجهريا من خلال وجود بقع بيضاء مميزة أو أغشية كاذبة على ظهر الألسنة. أكدت المقاطع النسيجية المرضية وجود كبير للخميرة والخيوط المقتصرة على الطبقة الكيراتينية للظهارة في مجموعة C-L ، وانخفض وجود الخلايا الفطرية بصريا في الصور التي تم الحصول عليها من الفئران المعرضة ل aPDT إما مع 40 ميكرومتر أو 80 ميكرومتر curcuminoids. aPDT بوساطة 80 ميكرومتر كوركومينويدس عززت انخفاض 2.47 سجل10 في عدد المستعمرات مقارنة بتلك الموجودة في مجموعة C-L- (p = 0.008). لم تظهر جميع المجموعات الأخرى أي انخفاض ذي دلالة إحصائية في عدد المستعمرات ، بما في ذلك مجموعات التحسس الضوئي (C + L-) أو الضوء وحده (C-L +). قلل aPDT بوساطة الكركمينو من الحمل الفطري من ألسنة الفئران.
Introduction
داء المبيضات الفموي (OC) هو العدوى الفطرية الرئيسية في تجويف الفم. وهو ناتج عن فرط نمو المبيضات النيابة. تشمل العوامل المؤهبة ل OC ضعف الغدد الصماء ، واستخدام المضادات الحيوية واسعة الطيف ، والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، ونقص التغذية ، وجفاف الفم (انخفاض تدفق اللعاب) ، واستخدام أطقم الأسنان ، وسوء النظافة ، وخاصة كبت المناعة1. من بين أنواع المبيضات ، المبيضات البيض هي الأكثر انتشارا وضراوة. تم العثور عليها كنوع متعايش في جسم الإنسان وكعامل ممرض انتهازي. C. albicans لديه القدرة على تغيير مورفولوجيته من الخمائر المتعايشة (الأريمية) إلى خيوط مسببة للأمراض (خيوط وخيوط كاذبة)2. يمكن للأشكال الخيطية ، وخاصة الخيوط ، أن تغزو ظهارة المضيف عن طريق الاختراق الخلوي أو الاختراق النشط ، مما يسبب العدوى3. تشمل عوامل الفوعة الأخرى ل C. albicans الالتصاق ، وتكوين الأغشية الحيوية ، وإفراز الإنزيمات والسموم المحللة للدهون والمائية ، مثل الليباز ، والفوسفوليباز ، والبروتينات ، والمبيضات4.
تتضمن علاجات OC استخدام العوامل المضادة للفطريات ، وخاصة البولينات الموضعية والأزول (النيستاتين والميكونازول)5. ومع ذلك ، فإنها تظهر فقط فعالية قصيرة الأجل ، والتكرار متكرر. بالإضافة إلى ذلك ، أدى الإفراط في استخدام مضادات الفطريات إلى ظهور مشكلة تطور المقاومة المضادة للفطريات وانتشارها6. لذلك ، هناك حاجة إلى علاجات بديلة ، مثل العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDT) ، والذي يجمع بين محسس ضوئي (PS) وضوء بطول موجي مناسب (مثل امتصاص PS) في وجود الأكسجين. ترتبط PSS بالخلايا أو تمتصها ، وعندما يتم تنشيطها بواسطة الضوء ، تنتج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) السامة للخلايا الحساسة7.
في aPDT ، أحد المحسسات الضوئية (PSs) المستخدمة هو الكركمين (CUR) ، وهو مركب طبيعي مستخرج من جذور نبات الكركم (Curcuma longa L.) يمتلك الكركمين العديد من السمات العلاجية ، بما في ذلك القدرات المضادة للالتهابات ومضادات الأكسدة والمضادة للسرطانومضادات الميكروبات 8,9. وجد تحقيق سابق أن aPDT باستخدام CUR قلل بشكل فعال من C. albicans في نموذج الفئران من داء المبيضات الفموي دون التسبب في أي ضرر لأنسجة المضيف10. CUR هو الكركمين الرئيسي المستخرج من الكركم ، ولكن توجد أيضا بوليفينول أخرى ، مثل ديميثوكسيكوركومين وثنائي ديميثوكسي كوركومين ، في هذا النبات. أظهر aPDT بوساطة الكركمينو نشاطا مضادا للبكتيريا ضد الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية الذهبية المزروعة في القسطرة11. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لا يزال نشاطه المضاد للفطريات ضد C. albicans غير واضح. لذلك ، في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم aPDT بوساطة ملح الكركمينويد ضد C. albicans في نموذج الفئران من OC.
Protocol
Representative Results
Discussion
ارتبطت C. albicans بالتهابات الفم والمريء لدى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة ، ومرض السكري ، والاستخدام المطول للمضادات الحيوية ، وسوء نظافة الفم1،3. تتطلب دراسة الأمراض المعدية البشرية تحقيقات في المختبر وفي الجسم الحي قبل أن يتم تصميم التج?…
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدعم المالي من FAPESP (مؤسسة أبحاث ساو باولو ، رقم العملية FAPESP # 2013 / 07276-1 (CePID CePOF) و 2008 / 00601-6. كما نشكر الدكتورة آنا باولا سيلفا على تقديم المعلومات حول الملح القابل للذوبان في الماء القائم على CUR.
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
- Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15 (2020).
- Sudbery, P. E. Growth of Candida albicans hyphae. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).
- Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface. Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).
- Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
- Quindós, G., et al. Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs. Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).
- Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).
- Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry. Frontiers in Microbiology. 13, 1020995 (2013).
- Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130 (2021).
- Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).
- Dovigo, L. N., et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).
- Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination. Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386 (2022).
- Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).
- Takakura, N., et al. A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush. Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).
- Mima, E. G., et al. Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis. OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).
- Solis, N. V., Filler, S. G. Mouse model of oropharyngeal candidiasis. Nature Protocol. 7 (4), 637-642 (2012).
- Marôco, J. . Análise Estatística com o SPSS Statistics 25. , (2018).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Experimental oral candidiasis in animal models. Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).
- Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. Role of mini-host models in the study of medically important fungi. The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).
- Carmello, J. C., et al. Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo. PLoS One. 11 (6), e0156947 (2016).
- Sakima, V. T., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis. Molecules. 23 (8), 2075 (2018).
- Abe, S., et al. A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).
- Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans. Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).
- Russell, C., Jones, J. H. Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats. Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).
- Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model. OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).
- Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice. Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).
- Hidalgo, K. J. R., et al. Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole. Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140 (2019).
