Terapia fotodinamica antimicrobica mediata da curcuminoidi su un modello murino di candidosi orale
Summary
Questo protocollo descrive l’applicazione della terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) in un modello murino di candidosi orale. L’aPDT è stata eseguita utilizzando una miscela solubile in acqua di curcuminoidi e luce LED blu.
Abstract
La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) è stata ampiamente studiata in vitro e i modelli animali preclinici di infezioni sono adatti per valutare trattamenti alternativi prima degli studi clinici. Questo studio descrive l’efficacia dell’aPDT in un modello murino di candidosi orale. Quaranta topi sono stati immunosoppressi con iniezioni sottocutanee di prednisolone e le loro lingue sono state inoculate utilizzando un tampone orale precedentemente imbevuto di una sospensione cellulare di C. albicans . La tetraciclina è stata somministrata tramite acqua potabile nel corso dell’esperimento. Cinque giorni dopo l’inoculazione fungina, i topi sono stati distribuiti in modo casuale in otto gruppi; Un nono gruppo di topi non infetti non trattati è stato incluso come controllo negativo (n = 5). Tre concentrazioni (20 μM, 40 μM e 80 μM) di una miscela di curcuminoidi sono state testate con una luce LED blu (89,2 mW/cm2; ~ 455 nm) e senza luce (gruppi C + L+ e C + L-, rispettivamente). Solo luce (C-L+), nessun trattamento (C-L-) e animali senza infezione sono stati valutati come controlli. I dati sono stati analizzati utilizzando i test ANOVA e Games-Howell di Welch (α = 0,05). La candidosi orale è stata stabilita in tutti gli animali infetti e visualizzata macroscopicamente attraverso la presenza di caratteristiche macchie bianche o pseudomembrane sul dorso delle lingue. Le sezioni istopatologiche hanno confermato una grande presenza di lievito e filamenti limitati allo strato cheratinizzato dell’epitelio nel gruppo C-L-, e la presenza di cellule fungine è risultata visivamente diminuita nelle immagini ottenute da topi sottoposti ad aPDT con curcuminoidi da 40 μM o 80 μM. L’aPDT mediata da 80 μM curcuminoidi ha promosso una riduzione di 2,47 log10 del numero di colonie rispetto a quelle del gruppo C-L- (p = 0,008). Tutti gli altri gruppi non hanno mostrato una riduzione statisticamente significativa del numero di colonie, compresi i gruppi fotosensibilizzanti (C+L-) o da soli (C-L+). L’aPDT mediata dai curcuminoidi ha ridotto il carico fungino dalle lingue dei topi.
Introduction
La candidosi orale (OC) è la principale infezione fungina del cavo orale; è causata dalla crescita eccessiva di Candida spp. I fattori predisponenti all’OC includono la disfunzione endocrina, l’uso di antibiotici ad ampio spettro, la radioterapia e la chemioterapia, le carenze nutrizionali, la xerostomia (basso flusso salivare), l’uso di protesi, la scarsa igiene e, soprattutto, l’immunosoppressione1. Tra le specie di Candida , la Candida albicans è la più diffusa e virulenta; Si trova come specie commensale nel corpo umano e come patogeno opportunista. C. albicans ha la capacità di cambiare la sua morfologia da lieviti commensali (blastopori) a filamenti patogeni (ife e pseudoife)2. Le forme filamentose, in particolare le ife, possono invadere l’epitelio ospite per endocitosi o penetrazione attiva, causando infezione3. Altri fattori di virulenza di C. albicans includono l’adesione, la formazione di biofilm e la secrezione di enzimi e tossine lipolitiche e idrolitiche, come lipasi, fosfolipasi, proteinasi e candidalisina4.
I trattamenti OC prevedono l’uso di agenti antimicotici, in particolare polieni e azoli topici (nistatina e miconazolo)5. Tuttavia, mostrano solo un’efficacia a breve termine e le recidive sono frequenti. Inoltre, l’uso eccessivo di antimicotici ha dato origine al problema dello sviluppo e della diffusione della resistenza antifungina6. Pertanto, sono necessarie terapie alternative, come la terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT), che combina un fotosensibilizzante (PS) e la luce a una lunghezza d’onda appropriata (la stessa di quella dell’assorbimento del PS) in presenza di ossigeno. I PS sono legati o assorbiti dalle cellule e, quando attivati dalla luce, producono specie reattive dell’ossigeno (ROS) che sono tossiche per le cellule sensibilizzate7.
Nell’aPDT, uno dei fotosensibilizzanti (PS) impiegati è la curcumina (CUR), un composto naturale estratto dai rizomi della pianta di curcuma (Curcuma longa L.). La curcumina possiede numerosi attributi terapeutici, tra cui capacità antinfiammatorie, antiossidanti, antitumorali e antimicrobiche 8,9. Un’indagine precedente ha rilevato che l’aPDT che utilizza CUR ha diminuito efficacemente C. albicans in un modello murino di candidosi orale senza causare alcun danno ai tessuti dell’ospite10. Il CUR è il principale curcuminoide estratto dalla curcuma, ma in questa pianta si trovano anche altri polifenoli, come la demetossicurcumina e la bis-demetossicurcumina. L’aPDT mediata da curcuminoidi ha dimostrato attività antibatterica contro i biofilm di Staphylococcus aureus cresciuti in cateteri11. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, la sua attività antimicotica contro C. albicans rimane poco chiara. Pertanto, in questo studio, abbiamo valutato l’aPDT mediata da un sale curcuminoide contro C. albicans in un modello murino di OC.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. albicans è stato associato a infezioni orali ed esofagee in individui con uno stato immunocompromesso, diabete mellito, uso prolungato di antibiotici e scarsa igiene orale 1,3. Lo studio delle malattie infettive umane richiede indagini sia in vitro che in vivo prima che gli studi clinici possano essere progettati in modo sicuro e accurato. Il presente studio descrive un metodo per stabilire un modello murino di OC, che può essere u…
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il sostegno finanziario di FAPESP (São Paulo Research Foundation, numero di processo FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) e 2008/00601-6. Ringraziamo anche la Dott.ssa Ana Paula Silva per averci fornito le informazioni sul sale idrosolubile a base di CUR.
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
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