THÉRAPIE PHOTODYNAMIQUE ANTIMICROBIENNE MÉDIÉE PAR LES CURCUMINOÏDES SUR UN MODÈLE MURIN DE CANDIDOSE BUCCALE
Summary
Ce protocole décrit l’application de la thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT) dans un modèle murin de candidose buccale. L’aPDT a été réalisée à l’aide d’un mélange hydrosoluble de curcuminoïdes et de lumière LED bleue.
Abstract
La thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT) a été largement étudiée in vitro, et les modèles animaux précliniques d’infections conviennent à l’évaluation de traitements alternatifs avant les essais cliniques. Cette étude décrit l’efficacité de l’aPDT dans un modèle murin de candidose buccale. Quarante souris ont été immunodéprimées avec des injections sous-cutanées de prednisolone, et leur langue a été inoculée à l’aide d’un écouvillon buccal préalablement trempé dans une suspension de cellules de C. albicans . La tétracycline a été administrée par l’eau potable au cours de l’expérience. Cinq jours après l’inoculation fongique, les souris ont été réparties au hasard en huit groupes ; Un neuvième groupe de souris non traitées et non infectées a été inclus comme témoin négatif (n = 5). Trois concentrations (20 μM, 40 μM et 80 μM) d’un mélange de curcuminoïdes ont été testées avec une lumière LED bleue (89,2 mW/cm2 ; ~455 nm) et sans lumière (groupes C+L+ et C+L-, respectivement). Des animaux légers seuls (C-L+), aucun traitement (C-L-) et des animaux sans infection ont été évalués comme témoins. Les données ont été analysées à l’aide de l’ANOVA de Welch et des tests Games-Howell (α = 0,05). La candidose buccale a été établie chez tous les animaux infectés et visualisée macroscopiquement par la présence de taches blanches ou de pseudomembranes caractéristiques sur le dos de la langue. Les coupes histopathologiques ont confirmé une forte présence de levures et de filaments limités à la couche kératinisée de l’épithélium dans le groupe C-L-, et la présence de cellules fongiques a été visuellement diminuée dans les images obtenues de souris soumises à l’aPDT avec des curcuminoïdes de 40 μM ou 80 μM. L’aPDT médiée par des curcuminoïdes de 80 μM a favorisé une réduction de 2,47 log10 du nombre de colonies par rapport à celles du groupe C-L- (p = 0,008). Tous les autres groupes n’ont montré aucune réduction statistiquement significative du nombre de colonies, y compris les groupes photosensibilisants (C+L-) ou légers seuls (C-L+). L’aPDT médiée par les curcuminoïdes a réduit la charge fongique de la langue des souris.
Introduction
La candidose buccale (CO) est la principale infection fongique de la cavité buccale ; elle est causée par la prolifération de Candida spp. Les facteurs prédisposant à la contraceptive orgueilleux comprennent le dysfonctionnement endocrinien, l’utilisation d’antibiotiques à large spectre, la radiothérapie et la chimiothérapie, les carences nutritionnelles, la xérostomie (faible débit salivaire), l’utilisation de prothèses dentaires, une mauvaise hygiène et, surtout, l’immunosuppression1. Parmi les espèces de Candida, Candida albicans est la plus répandue et la plus virulente ; On le trouve comme espèce commensale dans le corps humain et comme agent pathogène opportuniste. C. albicans a la capacité de changer sa morphologie de levures commensales (blastopores) en filaments pathogènes (hyphes et pseudohyphes)2. Les formes filamenteuses, en particulier les hyphes, peuvent envahir l’épithélium de l’hôte par endocytose ou pénétration active, provoquant une infection3. Les autres facteurs de virulence de C. albicans comprennent l’adhésion, la formation de biofilm et la sécrétion d’enzymes et de toxines lipolytiques et hydrolytiques, telles que les lipases, les phospholipases, les protéinases et la candidalysine4.
Les traitements par CO impliquent l’utilisation d’agents antifongiques, en particulier des polyènes topiques et des azoles (nystatine et miconazole)5. Cependant, ils ne montrent qu’une efficacité à court terme et les récidives sont fréquentes. De plus, la surutilisation d’antifongiques a donné lieu au problème du développement et de la propagation de la résistance aux antifongiques6. Par conséquent, des thérapies alternatives sont nécessaires, telles que la thérapie photodynamique antimicrobienne (TPDa), qui combine un photosensibilisateur (PS) et une lumière à une longueur d’onde appropriée (la même que celle de l’absorption du PS) en présence d’oxygène. Les PS sont liées aux cellules ou absorbées par elles et, lorsqu’elles sont activées par la lumière, produisent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui sont toxiques pour les cellules sensibilisées7.
Dans l’aPDT, l’un des photosensibilisants (PS) utilisés est la curcumine (CUR), un composé naturel extrait des rhizomes de la plante de curcuma (Curcuma longa L.). La curcumine possède de nombreux attributs thérapeutiques, notamment des capacités anti-inflammatoires, antioxydantes, anticancéreuses et antimicrobiennes 8,9. Une étude antérieure a révélé que l’aPDT utilisant CUR diminuait efficacement C. albicans dans un modèle murin de candidose buccale sans causer de dommages aux tissus de l’hôte10. Le CUR est le principal curcuminoïde extrait du curcuma, mais d’autres polyphénols, tels que la déméthoxycurcumine et la bis-déméthoxycurcumine, se trouvent également dans cette plante. L’aPDT médiée par les curcuminoïdes a démontré une activité antibactérienne contre les biofilms de Staphylococcus aureus cultivés dans des cathéters11. Cependant, à notre connaissance, son activité antifongique contre C. albicans reste incertaine. Par conséquent, dans cette étude, nous avons évalué l’aPDT médiée par un sel curcuminoïde contre C. albicans dans un modèle murin de CO.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. albicans a été associé à des infections buccales et œsophagiennes chez les personnes immunodéprimées, au diabète sucré, à l’utilisation prolongée d’antibiotiques et à une mauvaise hygiène bucco-dentaire 1,3. L’étude des maladies infectieuses humaines nécessite des investigations in vitro et in vivo avant que les essais cliniques puissent être conçus de manière sûre et précise. La présente étude décrit une…
Acknowledgements
Les auteurs remercient la FAPESP (Fondation de recherche de São Paulo, numéro de processus FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) et 2008/00601-6. Nous remercions également le Dr Ana Paula Silva pour avoir fourni les informations sur le sel soluble dans l’eau à base de CUR.
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
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