Curcuminoid-vermittelte antimikrobielle photodynamische Therapie an einem Mausmodell der oralen Candidiasis
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT) in einem Mausmodell der oralen Candidiasis. aPDT wurde mit einer wasserlöslichen Mischung aus Curcuminoiden und blauem LED-Licht durchgeführt.
Abstract
Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) wurde in vitro umfassend untersucht, und präklinische Tiermodelle von Infektionen eignen sich zur Bewertung alternativer Behandlungen vor klinischen Studien. Diese Studie beschreibt die Wirksamkeit der aPDT in einem murinen Modell der oralen Candidiasis. Vierzig Mäuse wurden mit subkutanen Injektionen von Prednisolon immunsupprimiert, und ihre Zungen wurden mit einem Mundabstrich geimpft, der zuvor in einer C. albicans-Zellsuspension getränkt war. Tetracyclin wurde im Verlauf des Experiments über das Trinkwasser verabreicht. Fünf Tage nach der Pilzimpfung wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in acht Gruppen eingeteilt; Eine neunte Gruppe unbehandelter nicht infizierter Mäuse wurde als Negativkontrolle eingeschlossen (n = 5). Drei Konzentrationen (20 μM, 40 μM und 80 μM) eines Gemisches von Curcuminoiden wurden mit blauem LED-Licht (89,2 mW/cm 2; ~455 nm) und ohne Licht (C+L+- bzw. C+L-Gruppen) getestet. Licht allein (C-L+), keine Behandlung (C-L-) und Tiere ohne Infektion wurden als Kontrollen bewertet. Die Daten wurden mit Welchs ANOVA- und Games-Howell-Tests analysiert (α = 0,05). Eine orale Candidiasis wurde bei allen infizierten Tieren festgestellt und makroskopisch durch das Vorhandensein charakteristischer weißer Flecken oder Pseudomembranen auf dem Zungenrücken visualisiert. Histopathologische Schnitte bestätigten ein großes Vorhandensein von Hefen und Filamenten, die auf die keratinisierte Schicht des Epithels in der C-L-Gruppe beschränkt waren, und das Vorhandensein von Pilzzellen war in den Bildern von Mäusen, die einer aPDT mit entweder 40 μM oder 80 μM Curcuminoiden unterzogen wurden, visuell verringert. aPDT, vermittelt durch 80 μM Curcuminoide, förderte eine Reduktion der Koloniezahlen um 2,47 log10 im Vergleich zu denen in der C-L-Gruppe (p = 0,008). Alle anderen Gruppen zeigten keine statistisch signifikante Verringerung der Anzahl der Kolonien, einschließlich Photosensibilisatoren (C+L-) oder Licht allein (C-L+) Gruppen. Curcuminoid-vermittelte aPDT reduzierte die Pilzlast von den Zungen von Mäusen.
Introduction
Orale Candidiasis (OC) ist die Hauptpilzinfektion der Mundhöhle; es wird durch das Überwachsen von Candida spp. verursacht. Zu den prädisponierenden Faktoren für OC gehören endokrine Dysfunktion, der Einsatz von Breitbandantibiotika, Strahlen- und Chemotherapie, Ernährungsmängel, Xerostomie (niedriger Speichelfluss), Prothesengebrauch, schlechte Hygiene und insbesondere Immunsuppression1. Unter den Candida-Arten ist Candida albicans die am weitesten verbreitete und virulente; Es kommt als kommensale Spezies im menschlichen Körper und als opportunistischer Krankheitserreger vor. C. albicans hat die Fähigkeit, seine Morphologie von kommensalen Hefen (Blastoporen) zu pathogenen Filamenten (Hyphen und Pseudohyphen) zu ändern2. Die fadenförmigen Formen, insbesondere die Hyphen, können durch Endozytose oder aktives Eindringen in das Wirtsepithel eindringen und eine Infektionverursachen 3. Andere Virulenzfaktoren von C. albicans sind Adhäsion, Biofilmbildung und Sekretion von lipolytischen und hydrolytischen Enzymen und Toxinen wie Lipasen, Phospholipasen, Proteinasen und Candidalysin4.
OC-Behandlungen beinhalten die Verwendung von Antimykotika, insbesondere topischen Polyenen und Azolen (Nystatin und Miconazol)5. Sie zeigen jedoch nur eine kurzfristige Wirksamkeit, und es kommt häufig zu Rezidiven. Darüber hinaus hat der übermäßige Gebrauch von Antimykotika zu dem Problem der Entwicklung und Ausbreitung von Antimykotika geführt6. Daher sind alternative Therapien erforderlich, wie z. B. die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT), die einen Photosensibilisator (PS) und Licht mit einer geeigneten Wellenlänge (der gleichen wie die PS-Absorption) in Gegenwart von Sauerstoff kombiniert. PSs sind an Zellen gebunden oder werden von diesen aufgenommen und produzieren, wenn sie durch Licht aktiviert werden, reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die für sensibilisierte Zellen toxisch sind7.
Bei der aPDT ist einer der verwendeten Photosensibilisatoren (PSs) Curcumin (CUR), eine natürlich vorkommende Verbindung, die aus den Rhizomen der Kurkumapflanze (Curcuma longa L.) gewonnen wird. Curcumin besitzt zahlreiche therapeutische Eigenschaften, darunter entzündungshemmende, antioxidative, krebshemmende und antimikrobielle Eigenschaften 8,9. Eine frühere Untersuchung ergab, dass aPDT unter Verwendung von CUR C. albicans in einem Mausmodell der oralen Candidiasis effektiv verringerte, ohne das Gewebe des Wirts zu schädigen10. CUR ist das wichtigste Curcuminoid, das aus Kurkuma gewonnen wird, aber auch andere Polyphenole wie Demethoxycurcumin und Bis-Demethoxycurcumin sind in dieser Pflanze enthalten. Curcuminoid-vermittelte aPDT zeigte antibakterielle Aktivität gegen Biofilme von Staphylococcus aureus, die in Kathetern gezüchtet wurden11. Nach unserem besten Wissen bleibt seine antimykotische Aktivität gegen C. albicans jedoch unklar. Daher haben wir in dieser Studie aPDT, die durch ein Curcuminoidsalz vermittelt wird, gegen C. albicans in einem Mausmodell von OC untersucht.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. albicans wurde mit oralen und ösophagealen Infektionen bei Personen mit immungeschwächtem Zustand, Diabetes mellitus, längerem Gebrauch von Antibiotika und schlechter Mundhygiene in Verbindung gebracht 1,3. Die Untersuchung menschlicher Infektionskrankheiten erfordert sowohl In-vitro– als auch In-vivo-Untersuchungen, bevor klinische Studien sicher und genau konzipiert werden können. Die vorliegende Studie beschreibt eine Methode …
Acknowledgements
Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch FAPESP (São Paulo Research Foundation, Prozessnummer FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) und 2008/00601-6. Wir danken auch Dr. Ana Paula Silva für die Bereitstellung der Informationen über das wasserlösliche Salz auf CUR-Basis.
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
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