Genom Düzenleme ve İlaç Dağıtımı için Yenidoğan Farenin İntratekal Enjeksiyonu
Summary
Mevcut protokol, gen düzenleme ve ilaç dağıtımı için yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için adım adım talimatları özetlemektedir.
Abstract
İntratekal enjeksiyon, hem pediatrik hem de yetişkin kliniklerinde yaygın olarak kullanılan bir prosedürdür ve ilaç ve tedavileri uygulamak için etkili bir araç olarak hizmet eder. Bu yöntem, ilaçları ve tedavileri doğrudan merkezi sinir sisteminin beyin omurilik sıvısına vererek, intravenöz, deri altı veya kas içi enjeksiyonlar gibi diğer yollara kıyasla sistemik yan etkileri azaltırken daha yüksek lokalize ilaç konsantrasyonları sağlar. İntratekal enjeksiyon, kemirgenlerde ve insan olmayan primatlar da dahil olmak üzere diğer büyük hayvanlarda nörogenetik bozuklukların tedavisine odaklanan klinik öncesi çalışmalarda hayati bir rol oynadığından, önemi klinik ortamların ötesine uzanır. Bununla birlikte, yaygın olarak uygulanmasına rağmen, genç, özellikle yenidoğan yavrularda intratekal enjeksiyon, küçük boyutları ve kırılgan yapıları nedeniyle önemli teknik zorluklar doğurmaktadır. Yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonların başarılı ve güvenilir bir şekilde uygulanması, ayrıntılara titizlikle dikkat edilmesini ve çeşitli faktörlerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirir. Bu nedenle, yalnızca talimatlar sağlamakla kalmayıp aynı zamanda prosedürel tutarlılığın yanı sıra hayvanların güvenliği ve refahını sağlamak için temel teknik hususları ve iyi laboratuvar uygulamalarını vurgulayan standart bir protokole çok önemli bir ihtiyaç vardır.
Bu karşılanmamış ihtiyacı karşılamak için, özellikle doğum sonrası 1. günde (P1) yenidoğan yavrularda intratekal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için ayrıntılı ve kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Araştırmacılar, adım adım talimatları izleyerek, yenidoğan yavrularında intratekal enjeksiyonları güvenle gerçekleştirebilir ve gen replasmanı veya genom düzenlemeye dayalı tedaviler için ilaçların, antisens oligoların ve virüslerin doğru bir şekilde verilmesini sağlayabilir. Ayrıca, hayvanların refahını korumak ve güvenilir deney sonuçları sağlamak için iyi laboratuvar uygulamalarına bağlı kalmanın önemi vurgulanmaktadır. Bu protokol, yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonlarla ilgili teknik zorlukları ele almayı ve sonuçta potansiyel terapötik müdahaleler geliştirmeyi amaçlayan nörogenetik araştırma alanındaki ilerlemeleri kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
Introduction
İntratekal (IT) enjeksiyon, kliniklerde hem pediatrik hem de yetişkin hastalarda ilaç uygulamak, beyin omurilik sıvısı toplamak ve kafa içi basıncı korumak için kullanılan yaygın bir klinik prosedürdür 1,2. İlaçların intratekal enjeksiyon yoluyla uygulanması, sistemik maruziyeti en aza indirirken merkezi sinir sistemindeki (MSS) ilaç konsantrasyonlarını artırmak için etkili bir yaklaşımdır. Sonuç olarak, bu yöntem terapötik etkinliği arttırır ve özellikle sıcaklığa duyarlı ve kısa yarı ömürlü ilaçlar için yan etkileri azaltır3.
Kemirgen modelleri kullanılarak yeni ilaçları ve tedavileri test eden klinik öncesi çalışmalarda, daha fazla hassasiyet ve sonuç tekrarlanabilirliği sunan güvenilir bir ilaç uygulama yönteminin kullanılması zorunludur 4,5. Nörogenetik ve nörogelişimsel bozukluklar için yeni tedavileri değerlendiren klinik öncesi çalışmalar için, erken tedavi, ilk kavram kanıtlama çalışmaları için çok önemlidir, çünkü daha önceki müdahalelerin tipik olarak daha olumlu sonuçlar vereceği tahmin edilmektedir 6,7,8.
Konvansiyonel intraserebrovataküler (ICV) enjeksiyonlarla karşılaştırıldığında, BT enjeksiyonları serebral korteksten doğrudan penetrasyon ihtiyacını ortadan kaldırdığı için önemli ölçüde daha düşük riskler taşır. Bu avantaj, bölgesel kortikal dokuya ve çevresindeki sinirlere olası hasarı önemli ölçüde azaltır. Ayrıca, BT enjeksiyonları, tek bir enjeksiyonla uygulanabilir ilaç hacminde en az beş kat artışa izin vererek, tekrarlanan uygulamaların fizibilitesini büyük ölçüde artırır. Bununla birlikte, yenidoğan farelerin küçük boyutu ve kırılgan doğası nedeniyle, yenidoğan yavrularda intratekal enjeksiyonların yapılması teknik olarak zordur ve özel teknikler, ekipman ve titiz kullanım gerektirir.
Bu makale, P1 yenidoğan yavrularında intratekal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için adım adım talimatlar içeren ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Uygulamanın tutarlılığını ve prosedür sırasında hayvanların güvenliğini ve refahını sağlamak için burada temel hususlar ve iyi laboratuvar uygulamaları vurgulanmaktadır. Araştırmacılar, bu protokolü izleyerek, hayvanlar için olası riskleri veya rahatsızlıkları en aza indirirken, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile deneyleri güvenle yürütebilirler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yenidoğan farelerde (P1) intratekal enjeksiyon için adım adım bir prosedür tarif edilmiştir ve beyinlerinde yaygın ilaç dağılımı ile sonuçlanır. Serebral korteks11’in delinmesini içeren yenidoğan farelere ilaç vermek için yaygın intraserebroventriküler enjeksiyon yöntemiyle karşılaştırıldığında, intratekal enjeksiyon, iğne penetrasyonu nedeniyle yenidoğan fare beyninin doğrudan yaralanmasını önler. Minimal invazivlik nedeniyle, intratekal enjeksiyon gerektiğinde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XNL, Angelman Sendromu Terapötik Vakfı (FAST) Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmektedir. YHJ ayrıca FAST ve NIH Grant R01HD110195 ve R01MH117289 tarafından da desteklenmektedir.
Materials
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
