Intrathecale injectie van pasgeboren muis voor genoombewerking en medicijnafgifte
Summary
Het huidige protocol schetst stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij neonatale muizen voor genbewerking en medicijnafgifte.
Abstract
Intrathecale injectie is een veelgebruikte procedure in zowel pediatrische als volwassen klinieken en dient als een effectief middel om medicijnen en behandelingen toe te dienen. Door medicijnen en behandelingen rechtstreeks in het hersenvocht van het centrale zenuwstelsel af te leveren, bereikt deze methode hogere gelokaliseerde geneesmiddelconcentraties en vermindert het systemische bijwerkingen in vergelijking met andere routes zoals intraveuze, subcutane of intramusculaire injecties. Het belang ervan reikt verder dan klinische omgevingen, aangezien intrathecale injectie een cruciale rol speelt in preklinische onderzoeken gericht op de behandeling van neurogenetische aandoeningen bij knaagdieren en andere grote dieren, waaronder niet-menselijke primaten. Ondanks de wijdverbreide toepassing brengt intrathecale injectie bij jongen, met name neonatale jongen, echter aanzienlijke technische uitdagingen met zich mee vanwege hun kleine formaat en fragiele aard. Succesvolle en betrouwbare toediening van intrathecale injecties bij pasgeboren muizen vereist nauwgezette aandacht voor detail en zorgvuldige afweging van verschillende factoren. Er is dus een cruciale behoefte aan een gestandaardiseerd protocol dat niet alleen instructies geeft, maar ook de belangrijkste technische overwegingen en goede laboratoriumpraktijken benadrukt om de consistentie van de procedure en de veiligheid en het welzijn van de dieren te waarborgen.
Om aan deze onvervulde behoefte te voldoen, presenteren we een gedetailleerd en uitgebreid protocol voor het uitvoeren van intrathecale injecties, specifiek bij pasgeboren pups op postnatale dag 1 (P1). Door de stapsgewijze instructies te volgen, kunnen onderzoekers vol vertrouwen intrathecale injecties uitvoeren bij neonatale pups, waardoor de nauwkeurige toediening van medicijnen, antisense-oligo’s en virussen voor genvervanging of op genoombewerking gebaseerde behandelingen mogelijk wordt. Bovendien wordt het belang van het naleven van goede laboratoriumpraktijken benadrukt om het welzijn van dieren te behouden en betrouwbare experimentele resultaten te garanderen. Dit protocol heeft tot doel de technische uitdagingen aan te pakken die gepaard gaan met intrathecale injecties bij neonatale muizen, en uiteindelijk de vooruitgang op het gebied van neurogenetisch onderzoek te vergemakkelijken dat gericht is op het ontwikkelen van potentiële therapeutische interventies.
Introduction
Intrathecale (IT) injectie is een veel voorkomende klinische procedure die wordt gebruikt om medicijnen toe te dienen, hersenvocht te verzamelen en de intracraniale druk te handhaven bij zowel pediatrische als volwassen patiënten in klinieken 1,2. De toediening van medicijnen via intrathecale injectie is een effectieve aanpak om de medicatieconcentraties in het centrale zenuwstelsel (CZS) te verhogen en tegelijkertijd de systemische blootstelling te minimaliseren. Bijgevolg verhoogt deze methode de therapeutische werkzaamheid en vermindert het de bijwerkingen, vooralvoor temperatuurgevoelige geneesmiddelen en geneesmiddelen met een korte halfwaardetijd3.
In preklinische studies waarin nieuwe geneesmiddelen en behandelingen worden getest met behulp van knaagdiermodellen, is het absoluut noodzakelijk om een betrouwbare methode voor de toediening van geneesmiddelen te gebruiken die een grotere precisie en reproduceerbaarheid van de resultaten biedt 4,5. Voor preklinische studies die nieuwe behandelingen voor neurogenetische en neurologische ontwikkelingsstoornissen evalueren, is vroege behandeling cruciaal voor initiële proof-of-concept-studies, omdat wordt voorspeld dat eerdere interventies doorgaans gunstigere resultaten opleveren 6,7,8.
In vergelijking met conventionele intracerebroventriculaire (ICV) injecties brengen IT-injecties aanzienlijk lagere risico’s met zich mee, omdat ze de noodzaak van directe penetratie door de hersenschors overbodig maken. Dit voordeel vermindert de potentiële schade aan regionaal corticaal weefsel en omliggende zenuwen aanzienlijk. Bovendien zorgen IT-injecties voor een ten minste vijfvoudige toename van het toedienbare volume van medicijnen door middel van een enkele injectie, waardoor de haalbaarheid van herhaalde toedieningen aanzienlijk wordt vergroot. Vanwege het kleine formaat en de fragiele aard van pasgeboren muizen is het uitvoeren van intrathecale injecties bij pasgeboren pups echter technisch uitdagend en vereist het gespecialiseerde technieken, apparatuur en nauwgezette behandeling.
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol met stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij P1-pasgeboren pups. De belangrijkste overwegingen en goede laboratoriumpraktijken worden hier benadrukt om de consistentie van de toediening en de veiligheid en het welzijn van de dieren tijdens de procedure te waarborgen. Door dit protocol te volgen, kunnen onderzoekers vol vertrouwen experimenten uitvoeren met precisie en reproduceerbaarheid, terwijl mogelijke risico’s of ongemak voor de dieren tot een minimum worden beperkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beschreven wordt een stap-voor-stap procedure voor intrathecale injectie bij neonatale muizen (P1), resulterend in een wijdverbreide distributie van geneesmiddelen in hun hersenen. In vergelijking met de gebruikelijke intracerebroventriculaire injectiemethode voor het toedienen van medicatie aan neonatale muizen, waarbij de hersenschors wordt doorboord11, voorkomt intrathecale injectie direct letsel aan de hersenen van neonatale muizen als gevolg van naaldpenetratie. Vanwege de minimale invasivite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XNL wordt ondersteund door de Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ wordt ook ondersteund door FAST en NIH Grant R01HD110195 en R01MH117289.
Materials
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
