Интратекальная инъекция новорожденной мыши для редактирования генома и доставки лекарств
Summary
В настоящем протоколе изложены пошаговые инструкции по выполнению интратекальных инъекций новорожденным мышам для редактирования генов и доставки лекарств.
Abstract
Интратекальная инъекция является широко используемой процедурой как в педиатрических, так и во взрослых клиниках, служащей эффективным средством для введения лекарств и лечения. Путем непосредственной доставки лекарств и методов лечения в спинномозговую жидкость центральной нервной системы, этот метод позволяет достичь более высоких локализованных концентраций лекарств при одновременном снижении системных побочных эффектов по сравнению с другими путями, такими как внутривенные, подкожные или внутримышечные инъекции. Его значение выходит за рамки клинических условий, поскольку интратекальная инъекция играет жизненно важную роль в доклинических исследованиях, направленных на лечение нейрогенетических расстройств у грызунов и других крупных животных, включая нечеловекообразных приматов. Однако, несмотря на широкое применение, интратекальные инъекции у молодых, особенно новорожденных детенышей, представляют собой значительные технические проблемы из-за их небольшого размера и хрупкой природы. Успешное и надежное введение интратекальных инъекций новорожденным мышам требует тщательного внимания к деталям и тщательного учета различных факторов. Таким образом, существует острая необходимость в стандартизированном протоколе, который не только содержит инструкции, но и освещает ключевые технические соображения и надлежащую лабораторную практику для обеспечения согласованности процедур, а также безопасности и благополучия животных.
Чтобы удовлетворить эту неудовлетворенную потребность, мы представляем подробный и всеобъемлющий протокол выполнения интратекальных инъекций, в частности, новорожденным щенкам на 1-й день после рождения (P1). Следуя пошаговым инструкциям, исследователи могут уверенно выполнять интратекальные инъекции новорожденным щенкам, обеспечивая точную доставку лекарств, антисмысловых олиго и вирусов для замены генов или лечения на основе редактирования генома. Кроме того, подчеркивается важность соблюдения надлежащей лабораторной практики для поддержания благополучия животных и обеспечения надежных результатов экспериментов. Этот протокол направлен на решение технических проблем, связанных с интратекальными инъекциями у новорожденных мышей, что в конечном итоге способствует прогрессу в области нейрогенетических исследований, направленных на разработку потенциальных терапевтических вмешательств.
Introduction
Интратекальная (ИТ) инъекция является распространенной клинической процедурой, используемой для введения лекарств, сбора спинномозговой жидкости и поддержания внутричерепного давления как у детей, так и у взрослых пациентов в клиниках 1,2. Введение лекарственных препаратов путем интратекальной инъекции является эффективным подходом для повышения концентрации лекарств в центральной нервной системе (ЦНС) при минимизации системного воздействия. Следовательно, этот метод повышает терапевтическую эффективность и уменьшает побочные эффекты, особенно для термочувствительных препаратов и препаратов с коротким периодом полувыведения3.
В доклинических исследованиях по испытанию новых лекарственных средств и методов лечения с использованием моделей грызунов необходимо использовать надежный метод введения лекарственных средств, обеспечивающий большую точность и воспроизводимость результатов 4,5. Для доклинических исследований, оценивающих новые методы лечения нейрогенетических расстройств и нарушений развития нервной системы, раннее лечение имеет решающее значение для первоначальных исследований, подтверждающих концепцию, поскольку более ранние вмешательства, как правило, дают более благоприятные исходы 6,7,8.
По сравнению с обычными внутримозговыми инъекциями (ИКВ), ИТ-инъекции сопряжены со значительно меньшими рисками, поскольку они устраняют необходимость прямого проникновения через кору головного мозга. Это преимущество существенно снижает потенциальное повреждение регионарной корковой ткани и окружающих нервов. Кроме того, ИТ-инъекции позволяют, по крайней мере, в пять раз увеличить объем вводимых лекарств за одну инъекцию, что значительно повышает возможность повторного введения. Однако из-за небольшого размера и хрупкой природы новорожденных мышей выполнение интратекальных инъекций новорожденным щенкам технически сложно и требует специализированных методов, оборудования и тщательного обращения.
В данной статье представлен подробный протокол с пошаговой инструкцией по выполнению интратекальных инъекций новорожденным щенкам P1. Здесь особое внимание уделяется ключевым соображениям и надлежащей лабораторной практике для обеспечения последовательности введения, а также безопасности и благополучия животных во время процедуры. Следуя этому протоколу, исследователи могут уверенно проводить эксперименты с точностью и воспроизводимостью, сводя к минимуму любые потенциальные риски или дискомфорт для животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описана пошаговая процедура интратекальной инъекции новорожденным мышам (Р1), приводящая к широкому распространению препарата в их головном мозге. По сравнению с распространенным методом внутримозговой инъекции для введения лекарства новорожденным мышам, который включает в себя про?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XNL поддерживается Фондом терапевтической терапии синдрома Ангельмана (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ также поддерживается FAST и NIH Grant R01HD110195 и R01MH117289.
Materials
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
