Preparo de Amostras para Criotomografia In Situ de Células de Mamíferos

1. Preparação da grelha NOTA: No planejamento experimental, planeje um máximo de 8-12 grades totais por sessão de congelamento de mergulho e 4-5 grades por poço. Mais do que isso, levará a uma sessão de congelamento de mergulho muito longa, o que pode causar aumento do estresse celular, contaminação por gelo e erros do usuário. Descarga de brilhoCarregue um número adequado de grades com um filme de suporte de carbono perfurado para ser descarregado a 15 mA por 45 s a 0,39 mBar atmosfera em um dispositivo de descarga de brilho. Certifique-se de que o lado carbono da grade está voltado para cima. Quando terminar, transfira as grades para um recipiente limpo forrado com papel filtro (Figura 1A1).NOTA: Outras grades podem ser usadas desde que o material não seja tóxico para as células (o que exclui qualquer grade de cobre). As grades do localizador são úteis para estudos correlativos. Grades feitas de outros materiais também são possíveis. Muitos laboratórios têm tido bons resultados cultivando células em cima de grades de suporte de SiO2 8,9. Tratamento aderenteTransfira as grades, fibronectina, PBS, placas e pinças para um gabinete de biossegurança. Trate ambos os lados das grades com 20 μg/mL de fibronectina bovina micropipetando dois pontos de solução aderente de tamanho generoso em uma superfície estéril, como a tampa de uma placa de 6 poços. Certifique-se de que os pontos são grandes o suficiente para envolver toda a grade (cerca de 100 μL é recomendado).NOTA: Antes do tratamento com a solução aderente selecionada, há a opção de foto-micropadronizar a grade aqui para otimizar a fixação das células no centro dos quadrados da grade. Reduzir a capacidade das células de se ligarem às barras aumentará o número de células imageáveis. Isso é ideal para experimentos envolvendo fresagem crioFIB. Use uma pinça 5/15 para manipular as grades. Certifique-se de tratar os dois lados da grade em solução.NOTA: Outras soluções adesivas podem ser utilizadas (fibrinogênio, colágeno, outros componentes da matriz extracelular, etc.). A fibronectina é usada aqui, pois dá bons resultados com uma grande variedade de linhagens celulares. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). A pinça 5/15 é útil, pois sua geometria permite uma melhor manobrabilidade em torno das placas de 6 poços, placas de 35 mm e microcorrediças. Isso resulta em menos estresse mecânico nas grades e um filme de carbono mais intacto. Certifique-se de que todos os materiais necessários sejam colocados no armário de biossegurança antes do início, pois isso reduz a possibilidade de contaminação da rede. Anexando gradesUma vez tratada com fibronectina bovina, a grade ficará pegajosa. Usando uma pinça 5/15, toque suavemente a superfície não carbônica da grade no fundo de um prato/prato vazio e abra a pinça. A grade deve ser facilmente fixada à nova superfície (Figura 1A2).NOTA: Tente evitar colocar grades no centro direto ou nas bordas do prato/prato. Ao adicionar células, há uma tendência para que a densidade celular se acumule no centro da placa. Isso pode resultar em grades com densidade celular excessiva. Alternativamente, os suportes de grade impressos em 3D podem ser usados aqui em vez de fixar células diretamente à superfície do prato/placa12. IncubaçãoIncubar as grades por 30 min na solução aderente à fibronectina (20 μg/mL). Para garantir que as grades não fiquem secas durante esse processo, a micropipeta 1-2 gotas de solução mais aderente diretamente sobre as grades a cada 15 min (Figura 1A3).NOTA: O período de incubação irá variar dependendo da solução aderente utilizada. Para fibronectina bovina, o tempo recomendado é de 30 min. LavagemApós o período de incubação, remova o excesso de solução aderente através de micropipetagem. Lave as grades por micropipetagem de gotas de PBS diretamente sobre as grades. Repita isso 2-3 vezes. (Figura 1A4). EsterilizaçãoUse luz UV para esterilizar as grades no armário de biossegurança por 1 h. Coloque as grades o mais próximo possível da fonte UV para maximizar a esterilização (Figura 1A5). Para garantir que as grades não fiquem secas durante esse processo, a micropipeta 1-2 gotas de PBS diretamente sobre as grades a cada 10 min.Observação : etapas 1.4-1.6 podem ser executadas simultaneamente. 2. Grades de semeadura Contagem de células:Destacar e contar as células usando métodos mecânicos ou enzimáticos. Determine o número ideal de células a serem usadas para semeadura antes da contagem. Para U2OS semeado em uma placa de 6 poços, use entre 6 x 104 a 1,6 x 105 células por poço (Figura 1B1).OBS: O número de células semeadas variará de acordo com o tipo de célula, a área superficial do poço, placa ou microlâmina utilizada, o tempo entre a semeadura e o congelamento por imersão e o desenho experimental. Teste um intervalo de números de células para identificar condições que resultarão em 0,25-1 células por quadrado de grade no momento do congelamento de imersão. É importante notar que a alta densidade celular reduz a velocidade de transferência de calor e pode afetar o processo de vitrificação. Para combater isso, alguns laboratórios têm encontrado sucesso usando filtros celulares, que atuam para evitar a formação de aglomerados celulares13. Finalmente, este protocolo resulta na fixação aleatória das células à camada de carbono. Se for necessário um acessório direcionado, pode ser utilizada foto-micropadronização (ver passo 1.3)14. Adição de células e meio de crescimento: Adicionar células via micropipeta aos poços, evitando bolhas (Figura 1B2). Em uma placa de 6 poços, recomenda-se um volume total de 1,5-2,0 mL no poço.NOTA: Recomenda-se molhar cuidadosamente ao redor das grades antes de adicionar todo o volume. Isso ajudará a evitar que as grades se desprendam e flutuem na solução. Mova suavemente a placa de um lado para o outro para facilitar a distribuição homogênea de células no poço. Não gire a placa em um movimento circular, pois isso resultará em alocação excessiva de densidade celular no centro do poço. Incubação: Incubar as lâminas a 37 °C por um tempo adequado de acordo com o planejamento experimental, que dependerá das aplicações a jusante. Para este exemplo (transfecção de clones moleculares do HIV), incubar entre 16-24 h (Figura 1B3).NOTA: Tempos de incubação mais longos resultarão em mais ciclos de divisão celular. Portanto, ajuste o número inicial de células para semeadura de acordo. 3. Transfecção Preparação da mistura de transfecção:Preparar um reagente lipossomal catiônico apropriado para transfecção de plasmídios na linhagem celular selecionada. Neste exemplo de transfecção, use 1 μg de DNA plasmidial total por poço (em uma placa de 6 poços) para ser transfectado em uma proporção de 1:3 de plasmídeo HIViΔEnv para plasmídeo psPAX2. Para cada poço, diluir 1 μg de DNA em 50 μL de DMEM livre de soro. Homogeneizar a mistura através de micropipetagem repetida ou redemoinho suave da placa. Para cada poço, diluir 3 μL de reagente de transfecção em DMEM sem soro e, em seguida, homogeneizar novamente a mistura por micropipetagem ou turbilhonamento suave. Adicionar toda a mistura diluída de reagentes de transfecção à mistura de ADN diluída (passo 3.1.2) e incubar à temperatura ambiente (TR) durante 15 minutos (figura 1C1).NOTA: Enquanto esta mistura estiver incubando, substitua o meio nos poços por 1,5 mL de DMEM fresco. Tenha cuidado para não desalojar as grades do fundo do poço. Para aplicar a mistura de transfecção, pipetar 100 μL da mistura da etapa 3.1.3 gota a gota para cada poço, concentrando as gotas sobre as grades para garantir o contato (Figura 1C2). Trocar o meio de cultura 16-24 h após a transfecção (Figura 1C3). 4. Congelamento por imersão NOTA: Mantenha as células a 37 °C até ser necessário para a mancha. Além disso, certifique-se de anotar o lado carbono das grades durante todo o processo. Densidade celularVerifique as grades em um microscópio óptico invertido e observe as densidades celulares em cada grade.Observação : grades com menos de 0,25 células por quadrado de grade (ou uma célula a cada 4 quadrados de grade), são consideradas ‘vazias’. Grades com 0,25-1 células por quadrado de grade são consideradas ‘normais’. Grades com mais de 1 célula por quadrado de grade são consideradas ‘cheias’. Anote a densidade celular em cada grade para permitir a discagem dos tempos de mancha mais tarde durante o congelamento por imersão. Adicionar 2-3 ml de PBS a um prato/prato vazio e aquecer a 37 °C. Preparação de fiduciáriosPara preparar fiduciais de ouro para aplicações de criotomografia a jusante, pipete 50 μL de solução de esferas de ouro coloidal de 10 nm em um tubo limpo de 1,5 mL. Adicionar 2 μL de 1 mg/mL de BSA ao tubo e homogeneizar por micropipetagem repetidamente. Centrifugar o tubo a 15.000-20.000 x g por 15 min. Micropipeta para remover o máximo possível do sobrenadante sem perturbar o pellet.OBS: O pellet estará muito solto. Adicionar 50 μL de PBS ao pellet e ressuspender. Centrifugar o tubo novamente a 15.000-20.000 x g por 15 min. Com uma ponteira de 10 μL, aspirar diretamente 4 μL do pellet e transferi-lo para um tubo limpo de 1,5 mL (Figura 1D1). Use 1 μL do ouro lavado e concentrado por grade.NOTA: O tipo de fiduciais utilizados depende das aplicações a jusante. Para a tomografia de TEM, utilizar esferas de ouro de 10 nm. Para tomografia de raios X moles, use contas de ouro de 200 nm. Para microscopia de correlação, utilizar esferas fluorescentes de látex. Fiduciais normalmente não são necessários para experimentos envolvendo moagem crioFIB, pois o processo de moagem irá destruí-los. ManchaMontagem da câmara ambiental a 95% de umidade e 30°C (Figura 1D1). Selecione uma grade usando a pinça 5/15. Lave as grades com PBS e transfira-as para uma pinça mergulhadora (Figura 1D2). Uma vez segura, remova a pinça 5/15 e deslize a pinça sobre a pinça mergulhadora. Insira a grade no congelador de imersão, mantendo a braçadeira segura (Figura 1D3). Adicione 1 μL de fiduciais de ouro ao lado de trás da grade (Figura 1D4). Adicione 2-3 μL de PBS ao lado carbono da grade. Use o blotting automatizado para manchar o lado traseiro da grade e mergulhar o congelamento em etano líquido (Figura 1D5).NOTA: Recomenda-se ter entre 3-4 μL de volume por grade para uma mancha ideal. As grades podem reter uma quantidade variável de PBS após a lavagem. Ajuste o volume adicional de PBS para levar em conta a retenção de líquidos pré-existente na rede. Recomenda-se que os fiduciais de ouro sejam adicionados à parte de trás da grade. A adição à frente pode resultar em piscinas de fiduciais de ouro perto do ponto de inserção, enquanto a adição da parte de trás resulta em uma solução mais homogeneizada. A duração do blotting depende da odontologia celular da grade. 2 s para vazio, 3 s para normal e 4 s para redes completas, respectivamente. O tipo de congelador de imersão disponível pode determinar como o blotting é abordado: O congelador de mergulho Leica GP2 é o usado neste protocolo e é capaz de blotting automatizado de face única por padrão. A Thermo Fisher Vitrobot faz blotting automatizado de dupla face, embora isso muitas vezes danifique as células ligadas ao lado do carbono. O blotting manual no Vitrobot também é possível, bem como êmbolos de gravidade manuais.