Preparación de muestras para criotomografía in situ de células de mamíferos

1. Preparación de la cuadrícula NOTA: En el diseño experimental, planifique un máximo de 8 a 12 rejillas en total por sesión de inmersión y congelación y de 4 a 5 rejillas por pozo. Más que eso conducirá a una sesión de congelación por inmersión muy larga, lo que puede causar un aumento del estrés celular, contaminación por hielo y errores del usuario. Descarga de incandescenciaCargue un número adecuado de rejillas con una película de soporte de carbono perforada para que se descargue a 15 mA durante 45 s a una atmósfera de 0,39 mBar en un dispositivo de descarga incandescente. Asegúrese de que el lado de carbono de la rejilla esté hacia arriba. Cuando termine, transfiera las rejillas a un recipiente limpio forrado con papel de filtro (Figura 1A 1).NOTA: Se pueden usar otras rejillas siempre que el material no sea tóxico para las celdas (lo que excluye cualquier rejilla de cobre). Las cuadrículas de búsqueda son útiles para estudios correlativos. También son posibles las rejillas hechas de otros materiales. Muchos laboratorios han obtenido buenos resultados en el cultivo de células sobre rejillas de soporte deSiO2 8,9. Tratamiento adherenteTransfiera las rejillas, la fibronectina, el PBS, las placas y las pinzas a un gabinete de bioseguridad. Tratar ambos lados de las rejillas con 20 μg/ml de fibronectina bovina mediante el micropipeteo de dos puntos de solución adherente de tamaño generoso sobre una superficie estéril, como la tapa de una placa de 6 pocillos. Asegúrese de que los puntos sean lo suficientemente grandes como para envolver toda la cuadrícula (se recomiendan alrededor de 100 μL).NOTA: Antes del tratamiento con la solución adherente seleccionada, existe la opción de foto-micropatrón de la cuadrícula aquí para optimizar la fijación de las celdas en el centro de los cuadrados de la cuadrícula. La reducción de la capacidad de las celdas para adherirse a las barras aumentará el número de celdas de las que se puede obtener una imagen. Esto es ideal para experimentos que involucran molienda crioFIB. Usa pinzas de 5/15 para manipular las cuadrículas. Asegúrese de tratar ambos lados de la rejilla en solución.NOTA: Se pueden utilizar otras soluciones adhesivas (fibrinógeno, colágeno, otros componentes de la matriz extracelular, etc.). Aquí se utiliza la fibronectina, ya que da buenos resultados con una amplia variedad de líneas celulares. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). La pinza 5/15 es útil ya que su geometría permite una mejor maniobrabilidad alrededor de las placas de 6 pocillos, las placas de 35 mm y las microcorrederas. Esto da como resultado menos estrés mecánico en las rejillas y una película de carbono más intacta. Asegúrese de que todos los materiales necesarios estén colocados en el gabinete de bioseguridad antes de comenzar, ya que esto reduce la posibilidad de contaminación de la red. Adjuntar rejillasUna vez tratada con fibronectina bovina, la rejilla se volverá pegajosa. Con unas pinzas de 5/15, toque suavemente la superficie sin carbono de la rejilla con el fondo de un plato/plato vacío y abra las pinzas. La rejilla debe adherirse fácilmente a la nueva superficie (Figura 1A2).NOTA: Trate de evitar colocar rejillas en el centro directo o en los bordes del plato/plato. Al agregar células, existe una tendencia a que la densidad celular se acumule en el centro de la placa. Esto puede dar lugar a redes con una densidad celular excesiva. Alternativamente, se pueden usar soportes de rejilla impresos en 3D en lugar de unir celdas directamente a la superficie del plato/placa12. IncubaciónIncubar las rejillas durante 30 min en la solución adherente de fibronectina (20 μg/mL). Para asegurarse de que las rejillas no se sequen durante este proceso, micropipetee 1-2 gotas de solución más adherente directamente sobre las rejillas cada 15 minutos (Figura 1A3).NOTA: El período de incubación variará según la solución adherente utilizada. Para la fibronectina bovina, el tiempo recomendado es de 30 min. LavadoDespués del período de incubación, elimine el exceso de solución adherente mediante micropipeteo. Lave las rejillas mediante el micropipeteo de gotas de PBS directamente sobre las rejillas. Repita esto 2-3 veces. (Figura 1A4). EsterilizaciónUtilice luz ultravioleta para esterilizar las rejillas de la cabina de bioseguridad durante 1 h. Coloque las rejillas lo más cerca posible de la fuente UV para maximizar la esterilización (Figura 1A5). Para asegurarse de que las rejillas no se sequen durante este proceso, micropipetee 1-2 gotas de PBS directamente sobre las rejillas cada 10 minutos.NOTA: Los pasos 1.4-1.6 se pueden realizar simultáneamente. 2. Rejillas de siembra Contar celdas:Separe y cuente las células utilizando métodos mecánicos o enzimáticos. Determine el número óptimo de celdas que se utilizarán para la siembra antes de contar. Para U2OS sembrado en una placa de 6 pocillos, use entre 6 x 104 y 1.6 x 105 celdas por pocillo (Figura 1B1).NOTA: El número de células sembradas variará según el tipo de célula, el área de superficie del pocillo, plato o microportaobjetos utilizado, el tiempo entre la siembra y la congelación por inmersión, y el diseño experimental. Pruebe un rango de números de celdas para identificar las condiciones que darán como resultado 0.25-1 celdas por cuadrado de cuadrícula en el momento de la congelación por inmersión. Es importante tener en cuenta que la alta densidad celular reduce la velocidad de transferencia de calor y puede afectar el proceso de vitrificación. Para combatir esto, algunos laboratorios han tenido éxito utilizando filtros celulares, que actúan para evitar quese formen grupos celulares. Finalmente, este protocolo da como resultado la unión aleatoria de las células a la capa de carbono. Si es necesario un accesorio específico, se puede utilizar el fotomicropatrón (véase el paso 1.3)14. Adición de células y medio de crecimiento: Añadir células a través de micropipeta a los pocillos, evitando burbujas (Figura 1B2). En una placa de 6 pocillos, se recomienda un volumen total de pocillos de 1,5 a 2,0 ml.NOTA: Se recomienda humedecer cuidadosamente alrededor de las rejillas antes de agregar todo el volumen. Esto ayudará a evitar que las rejillas se desprendan y floten en la solución. Mueva suavemente la placa de lado a lado para facilitar la distribución homogénea de las células en el pocillo. No gire la placa con movimientos circulares, ya que esto dará como resultado una asignación excesiva de densidad celular en el centro del pocillo. Incubación: Incubar los portaobjetos a 37 °C durante un tiempo adecuado según el diseño experimental, que dependerá de las aplicaciones posteriores. Para este ejemplo (transfección de clones moleculares del VIH), incubar entre 16-24 h (Figura 1B3).NOTA: Los tiempos de incubación más largos darán como resultado más ciclos de división celular. Por lo tanto, ajuste el número inicial de celdas para la siembra en consecuencia. 3. Transfección Preparación de la mezcla de transfección:Preparar un reactivo catiónico liposomado apropiado para la transfección de plásmidos en la línea celular seleccionada. En este ejemplo de transfección, utilice 1 μg de ADN plasmídico total por pocillo (en una placa de 6 pocillos) para transfectarlo en una proporción de 1:3 de plásmido VIHiΔEnv a plásmido psPAX2. Para cada pocillo, diluir 1 μg de ADN en 50 μL de DMEM sin suero. Homogeneizar la mezcla mediante micropipeteo repetido o un suave remolino de la placa. Para cada pocillo, diluir 3 μL de reactivo de transfección en DMEM sin suero y, a continuación, homogeneizar la mezcla de nuevo mediante micropipeteo o remolino suave. Añadir toda la mezcla diluida de reactivos de transfección a la mezcla de ADN diluida (paso 3.1.2) e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 15 min (Figura 1C1).NOTA: Mientras se incuba esta mezcla, reemplace el medio en los pocillos con 1.5 ml de DMEM fresco. Tenga cuidado de no desalojar las rejillas del fondo del pozo. Para aplicar la mezcla de transfección, pipetear 100 μL de la mezcla del paso 3.1.3 gota a gota en cada pocillo, concentrando las gotas sobre las rejillas para asegurar el contacto (Figura 1C2). Cambie el medio de cultivo 16-24 h después de la transfección (Figura 1C3). 4. Congelación por inmersión NOTA: Mantenga las células a 37 °C hasta que las necesite para el secado. Además, asegúrese de tomar nota del lado de carbono de las rejillas durante todo el proceso. Densidad celularVerifique las rejillas en un microscopio óptico invertido y anote las densidades celulares en cada rejilla.NOTA: Las cuadrículas con menos de 0,25 celdas por cuadrado de cuadrícula (o una celda cada 4 cuadrados de cuadrícula) se consideran “vacías”. Las cuadrículas con 0,25-1 celdas por cuadrado de cuadrícula se consideran “normales”. Las cuadrículas con más de 1 celda por cuadrado de cuadrícula se consideran “completas”. Tome nota de la densidad celular en cada cuadrícula para permitir la marcación de los tiempos de transferencia más tarde durante la congelación por inmersión. Añadir 2-3 ml de PBS a un plato/plato vacío y calentar a 37 °C. Preparación de fiducialesPara preparar fiduciales de oro para aplicaciones de criotomografía posteriores, pipetee 50 μL de solución de perlas de oro coloidal de 10 nm en un tubo limpio de 1,5 mL. Añadir 2 μL de 1 mg/mL de BSA al tubo y homogeneizar mediante micropipeteo repetidamente. Centrifugar el tubo a 15.000-20.000 x g durante 15 min. Micropipeta para eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar el gránulo.NOTA: El pellet quedará muy suelto. Añadir 50 μL de PBS al gránulo y volver a suspender. Centrifugar el tubo de nuevo a 15.000-20.000 x g durante 15 min. Con una punta de 10 μL, aspire directamente 4 μL del gránulo y transfiéralo a un tubo limpio de 1,5 ml (Figura 1D 1). Utilice 1 μL del oro lavado y concentrado por rejilla.NOTA: El tipo de fiduciales utilizados depende de las aplicaciones posteriores. Para la tomografía TEM, utilice perlas de oro de 10 nm. Para la tomografía de rayos X suaves, utilice perlas de oro de 200 nm. Para la microscopía de correlación, utilice perlas de látex fluorescentes. Normalmente, los fiduciales no son necesarios para los experimentos que involucran molienda crioFIB, ya que el proceso de molienda los destruirá. BlotConfigure la cámara ambiental al 95 % de humedad y a 30 °C (Figura 1D 1). Seleccione una cuadrícula con las pinzas de 5/15. Lave las rejillas con PBS y transfiéralas a unas pinzas de inmersión (Figura 1D2). Una vez asegurado, retire las pinzas de 5/15 y deslice la abrazadera en las pinzas de inmersión. Inserte la rejilla en el congelador de inmersión, manteniendo la abrazadera segura (Figura 1D3). Agregue 1 μL de fiduciales de oro a la parte posterior de la cuadrícula (Figura 1D4). Agregue 2-3 μL de PBS al lado de carbono de la rejilla. Utilice un secado automático para secar la parte posterior de la rejilla y sumergir la congelación en etano líquido (Figura 1D5).NOTA: Se recomienda tener entre 3-4 μL de volumen por rejilla para una transferencia óptima. Las rejillas pueden retener una cantidad variable de PBS después del lavado. Ajuste el volumen agregado de PBS para tener en cuenta la retención de líquidos preexistente en la red. Se recomienda que los fiduciales dorados se agreguen a la parte posterior de la cuadrícula. La adición en la parte delantera puede dar lugar a charcos de fiduciales de oro cerca del punto de inserción, mientras que la adición desde la parte posterior da como resultado una solución más homogeneizada. La duración del secado depende de la odontología celular de la red. 2 s para las cuadrículas vacías, 3 s para las normales y 4 s para las completas, respectivamente. El tipo de congelador de inmersión disponible puede determinar cómo se aborda la transferencia: El congelador de inmersión Leica GP2 es el que se utiliza en este protocolo y es capaz de transferir automáticamente una sola cara de forma predeterminada. Thermo Fisher Vitrobot realiza transferencias automáticas de doble cara, aunque esto a menudo daña las células unidas al lado de carbono. También es posible el bómbolo manual en el Vitrobot, así como los émbolos de gravedad manuales.