Préparation d’échantillons pour la cryotomographie in situ de cellules de mammifères

1. Préparation de la grille REMARQUE : Dans le plan expérimental, prévoir un maximum de 8 à 12 grilles au total par séance de congélation en plongée et de 4 à 5 grilles par puits. Plus que cela conduira à une très longue session de congélation en plongée, ce qui peut entraîner une augmentation du stress cellulaire, une contamination par la glace et des erreurs de l’utilisateur. Décharge luminescenteCharger un nombre approprié de grilles avec un film de support de carbone perforé à décharger à 15 mA pendant 45 s à 0,39 mBar d’atmosphère dans un dispositif de décharge luminescente. Assurez-vous que le côté carbone de la grille est orienté vers le haut. Lorsque vous avez terminé, transférez les grilles dans un récipient propre tapissé de papier filtre (Figure 1A1).REMARQUE : D’autres grilles peuvent être utilisées tant que le matériau n’est pas toxique pour les cellules (ce qui exclut toute grille en cuivre). Les grilles de recherche sont utiles pour les études corrélatives. Des grilles en d’autres matériaux sont également possibles. De nombreux laboratoires ont obtenu de bons résultats en cultivant des cellules au-dessus des grilles de support SiO2 8,9. Traitement adhérentTransférez les grilles, la fibronectine, le PBS, les plaques et la pince à épiler dans une enceinte de sécurité biologique. Traiter les deux côtés des grilles avec 20 μg/mL de fibronectine bovine en micropipetant deux points de solution adhérente de taille généreuse sur une surface stérile, comme le couvercle d’une plaque à 6 puits. Assurez-vous que les points sont suffisamment grands pour envelopper toute la grille (environ 100 μL est recommandé).REMARQUE : Avant le traitement avec la solution adhérente sélectionnée, il est possible de photo-micromodeler la grille ici pour optimiser la fixation des cellules au centre des carrés de la grille. La réduction de la capacité des cellules à s’attacher aux barres augmentera le nombre de cellules imageables. C’est idéal pour les expériences impliquant le fraisage cryoFIB. Utilisez une pince à épiler 5/15 pour manipuler les grilles. Assurez-vous de traiter les deux côtés de la grille en solution.REMARQUE : D’autres solutions adhésives peuvent être utilisées (fibrinogène, collagène, autres composants de la matrice extracellulaire, etc.). La fibronectine est utilisée ici, car elle donne de bons résultats avec une grande variété de lignées cellulaires. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). La pince à épiler 5/15 est utile car sa géométrie permet une meilleure maniabilité autour des plaques à 6 puits, des paraboles de 35 mm et des micro-lames. Il en résulte moins de contraintes mécaniques sur les grilles et un film de carbone plus intact. Assurez-vous que tous les matériaux requis sont placés dans l’enceinte de sécurité biologique avant de commencer, car cela réduit le risque de contamination du réseau. Fixation de grillesUne fois traitée avec de la fibronectine bovine, la grille deviendra collante. À l’aide d’une pince à épiler 5/15, touchez doucement la surface non carbonée de la grille au fond d’un plat ou d’une assiette vide et ouvrez la pince à épiler. La grille doit se fixer facilement à la nouvelle surface (Figure 1A2).REMARQUE : Essayez d’éviter de placer des grilles au centre direct ou sur les bords du plat / de l’assiette. Lors de l’ajout de cellules, la densité cellulaire a tendance à s’accumuler au centre de la plaque. Cela peut entraîner des grilles avec une densité cellulaire excessive. Alternativement, des supports de grille imprimés en 3D peuvent être utilisés ici au lieu de fixer des cellules directement à la surface du plat/de l’assiette12. IncubationIncuber les grilles pendant 30 min dans la solution adhérente à la fibronectine (20 μg/mL). Pour s’assurer que les grilles ne deviennent pas sèches pendant ce processus, micropipeter 1 à 2 gouttes de solution plus adhérente directement sur les grilles toutes les 15 minutes (Figure 1A3).REMARQUE : La période d’incubation variera en fonction de la solution adhérente utilisée. Pour la fibronectine bovine, le temps recommandé est de 30 min. LavageAprès la période d’incubation, éliminer l’excès de solution adhérente par micropipetage. Lavez les grilles en micropipetant des gouttes de PBS directement sur les grilles. Répétez cette opération 2-3 fois. (Figure 1A4). StérilisationUtilisez la lumière UV pour stériliser les grilles de l’enceinte de sécurité biologique pendant 1 h. Placez les grilles le plus près possible de la source d’UV pour maximiser la stérilisation (figure 1A5). Pour vous assurer que les grilles ne deviennent pas sèches pendant ce processus, micropipetez 1 à 2 gouttes de PBS directement sur les grilles toutes les 10 minutes.REMARQUE : Les étapes 1.4 à 1.6 peuvent être effectuées simultanément. 2. Grilles de semis Compter les cellules :Détacher et compter les cellules à l’aide de méthodes mécaniques ou enzymatiques. Déterminez le nombre optimal de cellules à utiliser pour l’ensemencement avant le comptage. Pour U2OS ensemencé dans une plaque à 6 puits, utilisez entre 6 x 104 et 1,6 x 105 cellules par puits (Figure 1B1).REMARQUE : Le nombre de cellules ensemencées varie en fonction du type de cellule, de la surface du puits, de la boîte ou de la microlame utilisée, du temps écoulé entre l’ensemencement et la congélation en plongée et du plan expérimental. Testez une plage de numéros de cellules pour identifier les conditions qui se traduiront par 0,25 à 1 cellule par carré de grille au moment de la congélation en plongée. Il est important de noter qu’une densité cellulaire élevée réduit la vitesse de transfert de chaleur et peut avoir un impact sur le processus de vitrification. Pour lutter contre cela, certains laboratoires ont réussi à utiliser des tamis cellulaires, qui agissent pour empêcher la formation d’amas cellulaires13. Enfin, ce protocole aboutit à la fixation aléatoire des cellules à la couche de carbone. Si une fixation ciblée est nécessaire, un photo-micromotif peut être utilisé (voir étape 1.3)14. Ajout de cellules et de milieu de culture : Ajouter des cellules à l’aide d’une micropipette dans les puits, en évitant les bulles (Figure 1B2). Dans une plaque à 6 puits, un volume total de puits de 1,5 à 2,0 ml est recommandé.REMARQUE : Il est recommandé de mouiller soigneusement autour des grilles avant d’ajouter tout le volume. Cela aidera à empêcher les grilles de se détacher et de flotter dans la solution. Déplacez doucement la plaque d’un côté à l’autre pour faciliter la distribution homogène des cellules sur le puits. Ne faites pas tourner la plaque dans un mouvement circulaire, car cela entraînerait une densité cellulaire excessive au centre du puits. Incubation : Incuber les lames à 37 °C pendant un temps approprié selon le plan expérimental, qui dépendra des applications en aval. Dans cet exemple (transfection de clones moléculaires du VIH), incuber entre 16 et 24 h (Figure 1B3).REMARQUE : Des temps d’incubation plus longs entraîneront plus de cycles de division cellulaire. Par conséquent, ajustez le nombre de cellules de départ pour l’ensemencement en conséquence. 3. Transfection Préparation du mélange de transfection :Préparez un réactif liposomique cationique approprié pour la transfection plasmidique dans la lignée cellulaire sélectionnée. Dans cet exemple de transfection, utilisez 1 μg d’ADN plasmidique total par puits (dans une plaque à 6 puits) à transfecter dans un rapport de 1 :3 entre le plasmide HIViΔEnv et le plasmide psPAX2. Pour chaque puits, diluer 1 μg d’ADN dans 50 μL de DMEM sans sérum. Homogénéiser le mélange par micropipetage répété ou par un léger tourbillonnement de la plaque. Pour chaque puits, diluer 3 μL de réactif de transfection dans du DMEM sans sérum, puis homogénéiser à nouveau le mélange par micropipetage ou tourbillonnage doux. Ajouter l’ensemble du mélange de réactifs de transfection dilué au mélange d’ADN dilué (étape 3.1.2) et incuber à température ambiante (RT) pendant 15 min (Figure 1C1).REMARQUE : Pendant l’incubation de ce mélange, remplacez le milieu dans les puits par 1,5 mL de DMEM frais. Attention à ne pas déloger les grilles du fond du puits. Pour appliquer le mélange de transfection, pipeter 100 μL du mélange de l’étape 3.1.3 goutte à goutte dans chaque puits, en concentrant les gouttes sur les grilles pour assurer le contact (figure 1C2). Changez le milieu de culture 16 à 24 h après la transfection (Figure 1C3). 4. Congélation en plongée REMARQUE : Conservez les cellules à 37 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin pour le transfert. De plus, assurez-vous de noter le côté carbone des grilles tout au long du processus. Densité cellulaireVérifiez les grilles dans un microscope optique inversé et notez les densités de cellules sur chaque grille.REMARQUE : Les grilles de moins de 0,25 cellule par carré de grille (ou une cellule toutes les 4 cases de grille) sont considérées comme « vides ». Les grilles de 0,25 à 1 cellule par carré de grille sont considérées comme « normales ». Les grilles de plus de 1 cellule par carré de grille sont considérées comme « pleines ». Prenez note de la densité de cellules sur chaque grille pour permettre la numérotation des temps de transfert plus tard pendant la congélation en plongée. Ajouter 2 à 3 mL de PBS dans une assiette ou un plat vide et chauffer à 37 °C. Préparation des repèresPour préparer les repères d’or pour les applications de cryotomographie en aval, pipeter 50 μL de solution de billes d’or colloïdal de 10 nm dans un tube propre de 1,5 mL. Ajouter 2 μL de BSA à 1 mg/mL dans le tube et homogénéiser par micropipetage répété. Centrifuger le tube à 15 000-20 000 x g pendant 15 min. Micropipette pour éliminer le plus possible le surnageant sans perturber la pastille.REMARQUE : Le granulé sera très lâche. Ajouter 50 μL de PBS à la pastille et remettre en suspension. Centrifugez à nouveau le tube à 15 000-20 000 x g pendant 15 min. À l’aide d’un embout de 10 μL, aspirez directement 4 μL de la pastille et transférez-la dans un tube propre de 1,5 mL (Figure 1D1). Utilisez 1 μL d’or lavé et concentré par grille.REMARQUE : Le type de repères utilisés dépend des applications en aval. Pour la tomographie MET, utilisez des billes d’or de 10 nm. Pour la tomographie à rayons X mous, utilisez des billes d’or de 200 nm. Pour la microscopie de corrélation, utilisez des billes de latex fluorescentes. Les repères ne sont normalement pas nécessaires pour les expériences impliquant le broyage cryoFIB, car le processus de broyage les détruirait. BuvardRéglez la chambre climatique à 95 % d’humidité et à 30 °C (Figure 1D1). Sélectionnez une grille à l’aide de la pince à épiler 5/15. Lavez les grilles avec du PBS et transférez-les dans une pince à épiler plongeante (Figure 1D2). Une fois fixé, retirez la pince à épiler 5/15 et faites glisser la pince sur la pince à épiler plongeante. Insérez la grille dans le congélateur plongeant en maintenant la pince bien fixée (Figure 1D3). Ajouter 1 μL de repères en or à l’arrière de la grille (figure 1D4). Ajoutez 2 à 3 μL de PBS du côté carbone de la grille. Utilisez le transfert automatisé pour éponger la face arrière de la grille et plonger le congélateur dans de l’éthane liquide (figure 1D5).REMARQUE : Il est recommandé d’avoir entre 3 et 4 μL de volume par grille pour un buvard optimal. Les grilles peuvent retenir une quantité variable de PBS après le lavage. Ajustez le volume supplémentaire de PBS pour tenir compte de la rétention de liquide préexistante sur le réseau. Il est recommandé d’ajouter les repères d’or à l’arrière de la grille. L’ajout à l’avant peut entraîner des flaques de repères d’or près du point d’insertion, tandis que l’ajout à l’arrière donne une solution plus homogénéisée. La durée du transfert dépend de la dentisterie cellulaire de la grille. 2 s pour vide, 3 s pour normal et 4 s pour les grilles pleines, respectivement. Le type de congélateur plongeant disponible peut déterminer la façon dont le transfert est abordé : le congélateur plongeant Leica GP2 est celui utilisé dans ce protocole et est capable d’automatiser le transfert unilatéral par défaut. Thermo Fisher Vitrobot effectue un transfert double face automatisé, bien que cela endommage souvent les cellules attachées au côté carbone. Il est également possible d’effectuer un transfert manuel dans le Vitrobot, ainsi que des pistons manuels à gravité.