Diese Methode bietet ein zugängliches und flexibles Protokoll für die Herstellung von Elektronenmikroskopie-Gittern (EM) für die zelluläre In-situ-Kryotomographie und die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM).
Die zelluläre In-situ-Kryotomographie ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung komplexer Objekte in ihrem nativen gefroren-hydratisierten zellulären Kontext, was sie für die Zellbiologie und Virologie von hoher Relevanz macht. Das Potenzial der Kombination der Kryotomographie mit anderen Mikroskopiemodalitäten macht sie zu einer perfekten Technik für die integrative und korrelative Bildgebung. Die Probenvorbereitung für die In-situ-Zelltomographie ist jedoch nicht einfach, da sich die Zellen nicht ohne weiteres über das Elektronenmikroskopiegitter anlagern und strecken. Darüber hinaus sind die Gitter selbst zerbrechlich und können bei zu starker Handhabung brechen, was zum Verlust von bildbaren Bereichen führt. Auch die Geometrie von Gewebekulturschalen kann eine Herausforderung darstellen, wenn die Gitter mit einer Pinzette manipuliert werden. Hier beschreiben wir die Tipps und Tricks, um diese (und andere) Herausforderungen zu meistern und qualitativ hochwertige Proben für die zelluläre In-situ-Kryotomographie und die korrelative Bildgebung adhärenter Säugetierzellen vorzubereiten. Mit den kontinuierlichen Fortschritten in der Kryomikroskopie-Technologie ist diese Technik enorm vielversprechend, um unser Verständnis komplexer biologischer Systeme zu verbessern.
Die zelluläre In-situ-Kryotomographie ist eine leistungsfähige Technik, die es ermöglicht, biologisch relevante Strukturen in Zellen ohne chemische Fixierung zu untersuchen. Durch das Anheften von Zellen an EM-Gitter und das Einfrieren der Gitter in einem Kryogen werden Objekte von Interesse in ihren natürlichen zellulären Kontexten eingefroren, ohne dass kristallines Eis aus intrazellulärem Wasser gebildet wird 1,2. Sowohl die chemische Fixierung als auch die Bildung von kristallinem Eis können die Strukturen relevanter Moleküle wie Proteine und Lipide stören und die biologische Genauigkeit der mit diesen Techniken erhaltenen Bilder verringern 3,4. In der Tomographie werden Gitter mit Hilfe der Elektronenmikroskopie in inkrementellen Winkeln abgebildet, und diese Bilder werden dann verwendet, um dreidimensionale Darstellungen des abgebildeten Zielbereichszu konstruieren 5. Die In-situ-Kryotomographie kann zusammen mit anderen Mikroskopietechniken für die integrative und korrelative Bildgebung eingesetzt werden, wie z. B. Kryofluoreszenzbildgebung, Soft-Röntgentomographie und KryoFIB/REM (kryogene fokussierte Ionenstrahl-/Rasterelektronenmikroskopie)6,7,8,9,10,11 . Durch die Integration mehrerer Techniken können mehr Informationen über eine Struktur oder einen Prozess gewonnen werden, als es mit einer einzelnen Mikroskopietechnik möglich wäre.
Trotz aller Vorteile der zellulären In-situ-Kryotomographie kann sich die Probenvorbereitung aus verschiedenen Gründen als Herausforderung erweisen. Aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit kann eine gewaltsame Manipulation von Elektronenmikroskopie-Gittern zu Schäden führen, wobei insbesondere die dünne Kohlenstoffschicht empfindlich und reißanfällig ist, wodurch die abbildbare Fläche der Gitter reduziert wird. Elektronenmikroskopie-Gitter sind aufgrund ihrer geringen Größe auch schwer zu manipulieren und neigen dazu, sich von der Oberfläche der Vertiefungen oder Mikroobjektträger zu lösen, die zum Züchten von Zellen verwendet werden. Die Manipulation der Gitter innerhalb der Vertiefungen oder Mikrorutschen kann sich aufgrund der Geometrie dieser als schwierig erweisen. Eine unsachgemäße Vorbereitung der Gitter (z. B. Floating) kann zu einer geringen Zelldichte und einer Verringerung der Anzahl potenzieller Bildgebungsbereiche führen, insbesondere wenn die Zellen nicht dazu neigen, sich an die Gitter selbst anzuheften. Für die direkte zelluläre Kryotomographie müssen sich die Zellen sehr dünn ausbreiten, was aus vielen Gründen gestört werden kann, z. B. bei unsachgemäßen Temperaturen oder unsachgemäßer Handhabung der Gitter.
Durch eine Vielzahl von Optimierungen sollen die in diesem Artikel vorgestellten Techniken diese häufigsten Fallstricke lösen, die bei der Herstellung von elektronenmikroskopischen Gittern für die Kryotomographie auftreten. Die Verwendung einer abgewinkelten 5/15-Pinzette ermöglicht die Manipulation von Gittern innerhalb von Well-Platten oder Mikroobjektträgern. Eine Fibronektinlösung, die vor der Beschichtung auf beide Seiten der Gitter aufgetragen wird, macht schwimmende Gitter unwahrscheinlicher, was vorteilhaft ist, um sicherzustellen, dass die Gitter eine ausreichende Zelldichte aufweisen und dass die Gitter weniger wahrscheinlich durch Manipulation beschädigt werden. Indem wir die Gitter bis kurz vor dem Einfrieren bei 37 °C inkubieren, stellen wir auch sicher, dass die Zellen in einer angenehmen Umgebung gehalten werden, um zu verhindern, dass die Zellen ihre dünnen Ränder zurückziehen. Das Abtupfen der Gitter von der Rückseite verhindert auch eine Beschädigung der Zellen durch mechanische Krafteinwirkung. Insgesamt erhöhen diese Maßnahmen die Erfolgsrate der Probenvorbereitung für zelluläre In-situ-Kryotomographie-Studien und erhöhen die Zugänglichkeit dieses bildgebenden Ansatzes.
Hier haben wir ein zugängliches, flexibles und reproduzierbares Protokoll für Saatzellen auf elektronenmikroskopischen Gittern für In-situ-Kryoelektronentomographie-Anwendungen bereitgestellt. Diese Methode kann leicht an die Bedürfnisse nachgelagerter Anwendungen und/oder experimenteller Anforderungen angepasst werden. Neben der großen Flexibilität haben wir einen Arbeitsablauf beschrieben, der häufige Fallstricke bei der Gitteraussaat optimiert und reduziert, insbesondere umfangreiche Schäden an der Kohlenstoffschicht, geringe Zelldichte und schlechte strukturelle Integrität von dünnen Zellprojektionen.
Obwohl das hier beschriebene Protokoll mehrere Alternativen bietet, gibt es einige kritische Schritte, die befolgt werden sollten, um die allgemeinen Ergebnisse zu optimieren. Eines der größten Probleme bei der Aussaat von Gitterzellen ist das Ablösen und Schweben von Gittern aus dem Well oder dem Mikroobjektträger. Daher ist es wichtig, das Gitter auf beiden Seiten vollständig mit einer anhaftenden Lösung zu benetzen und ein Austrocknen während der Inkubationszeit zu verhindern. Wenn Sie 3D-gedruckte Gitterhalter verwenden, beachten Sie, dass mehrere Medienwechsel zu diesen Haltern das Potenzial haben, schwimmende Gitter zu erzeugen, da die unter dem Gitter eingeschlossene Luft sie aus dem Halter drücken kann.
Unsere Wahl der Pinzette verbessert auch die Gitterqualität, indem sie eine geometrisch günstige Möglichkeit bietet, die Gitter zu manipulieren, ohne dass das Gitter übermäßig gebogen wird, was die Kohlenstoffschicht beschädigen würde. Die Zellen so lange wie möglich bei 37 °C zu halten, bevor sie eintauchen, reduziert das Zellleiden und verbessert die Anzahl der dünnen, abbildbaren Zellen auf dem Gitter. Schließlich schützt das Blotting von der Goldseite die Zellen vor harten mechanischen Kräften, die zu einer Schädigung empfindlicher Zellstrukturen führen können.
Obwohl sie nicht in diesem Protokoll enthalten ist, hat sich gezeigt, dass die Gitter-Photomikrostrukturierung die Anzahl der abbildbaren Zellen erhöht, indem ihre Befestigung an der Mitte von Gitterquadraten14 optimiert wird. Schließlich wurden kürzlich 3D-gedruckte Gitterhalter verwendet, um Gitterschäden zu reduzieren, indem sie die direkte Manipulation des Gitters einschränken12.
Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll für die Bildgebung von dünnen Kanten und Ausstülpungen von Zellen für die Anwendung der Kryotomographie optimiert ist. Wir empfehlen die Fehlerbehebung bei einer Vielzahl von Bedingungen aus unseren Empfehlungen im Protokoll, um das beste Ergebnis für die nachgelagerten Anwendungen Ihrer Wahl zu finden. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine zuverlässige und dennoch vielseitige Methode zur Aussaat von Zellen auf Gittern, die für spezifische Anforderungen optimiert werden können.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem Mansky-Labor für den Zugang zu Tauchgefriergeräten. Teile dieser Arbeiten wurden in der Charakterisierungseinrichtung der University of Minnesota durchgeführt, die teilweise von der National Science Foundation (NSF) über das Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC; Preisnummer DMR-2011401) und der National Neuroscience Curriculum Initiative (NNCI; Fördernummer ECCS-2025124) Programmen. Wir bedanken uns für die Finanzierung durch das Behavior of HIV in Viral Environments Center (B-HIVE; 1U54AI170855-01) und das Duke Center for HIV Structural Biology (DCHSB; U54AI170752) Mitte.
10 nm colloidal gold bead solution | Sigma-Aldrich | 741957 | |
6 well multidish, 100/CS | Fisher Scientific | FB012927 | |
Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz | Beckman-Coulter | C63125 | |
Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon | Quantifoil | TEM-G300F1-AU | |
Bovine serum albumin | MilliporeSigma | A9647 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
DMi1 Inverted Microscope | Leica | 22A00G119 | |
Dulbecco's modified eagle's medium – high glucose, no glutamine | Gibco | 11-960-044 | |
Dumont 5/15 tweezer | Electron Microscopy Sciences | 0103-5/15-PO | |
EM GP2 | Leica | 587085 | Automated plunge freezer |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5209 | |
Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade | MilliporeSigma | F1141 | |
GenJet version II in vitro DNA transfection reagent | SignaGen Laboratories | SL100489 | |
GlutaMAX I 100x | Fisher Scientific | 35050061 | Media supplement |
Neslab EX-211 Heating Circulator | Neslab | Out of production | Water bath for media warming |
Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-100 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Pelco easyGlow device | Pelco | 91000S | Glow discharge device |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Media supplement |
Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector | Gilson | F144059M | |
Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector | Gilson | F144054M | |
Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector | Gilson | F144056M | |
Whatman number 2 filter paper, 55 mm | Whatman | 28455-041 | Blotting paper |